2个蓝莓品种叶片离体培养技术研究

杨玉春，王 莉，杨艳敏，孙 斌，田 颖，刘 成*

（1 辽宁省果树科学研究所，辽宁 熊岳115009；2 辽宁省凌海市果蚕管理局，辽宁 凌海121200）

蓝莓的组织培养研究最早始于1976年，Hall在矮丛蓝莓上进行茎段培养[1]。随后Sharon G.Billings，Rowland等又进行了蓝莓的离体叶片再生研究。离体叶片再生是指利用离体叶片，在适宜培养基、激素种类及其浓度的培养环境下进行培养，得到完整植株的技术[2，3]。蓝莓作为一种新兴的小浆果近年来得到迅猛发展，建立完整的叶片再生体系可以有效保存蓝莓的种质资源、加速品种选育和资源更新。离体叶片再生技术研究的主要内容集中在培养基类型、激素种类及其浓度、暗培养时间等方面。蓝莓的离体叶片再生受到内因和外因两方面限制。内因即基因型，是蓝莓离体叶片再生的主要限制因子；外因是指激素种类及其浓度、温度、pH 值、培养基类型、暗培养时间等因素。本试验以两个蓝莓品种即北高丛蓝莓‘斯巴坦’和半高丛蓝莓‘北陆’为试材，系统研究培养基中不同激素种类及其浓度配比、不同pH 值、叶片处理方式及暗培养对离体叶片再生的影响。拟初步建立‘斯巴坦’和‘北陆’的叶片再生体系，以期为蓝莓的快速、高效、规模化生产奠定基础。

1 试验材料

供试品种如前述。试验在辽宁省果树科学研究所小浆果研究室组织培养室中进行，配制好的培养基经120 ℃高压灭菌20 min后自然冷却备用。在温度 （24±2）℃、相对湿度80%、光周期12 h、暗期12 h，光强2 000 lx的条件下培养。每处理接种60片叶，3次重复。试验材料均为无菌组培苗，全部由辽宁省果树科学研究所小浆果研究室提供。

2 试验方法

2.1 培养基选择

2.1.1 最佳培养基选择试验

以WPM 培养基为基本培养基，添加糖30 g/L。采用正交试验设计，添加不同浓度ZT、IAA 进行匹配，每处理5 次重复（表1）。8 周后调查叶片再生率，以再生率最高的培养基为基础培养基。

表1 再生培养基不同激素浓度配比

2.1.2 最适pH 值和琼脂浓度选择试验

以培养基A5 为基础，pH 值设4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 ，共6 个梯度，再依次搭配不同浓度琼脂（表2）。将蓝莓组培苗离体叶片接种到培养基上，每处理10次重复。每周记录不同处理各品种叶片的再生率、再生时间、愈伤组织大小、叶色及长势，选择最佳培养基pH值。

表2 不同pH 值培养基的琼脂量 g

2.2 叶片创伤和放置方式试验

采用A5 培养基，pH 值调到4.5，选择长势一致、大小相近的叶片，以酒精燃烧消毒的剪刀剪去叶片一部分。设叶面向上、叶背向上两种摆放形式；创伤形式设叶柄端、叶尖端、叶两端各剪去1/3，共3 个处理，每处理10 次重复。接种后8 周调查不同叶片处理方式的再生时间、再生率。选择最佳叶片放置方式。

2.3 暗培养时间试验

接种后放入暗培养箱中进行暗培养，设0、7、14、21 d，共4 个处理，每处理5 次重复。培养8 周后调查再生时间和再生率，拟选择最佳暗培养时间。

3 结果与分析

3.1 激素种类及其浓度组合对叶片再生率的影响

由表3可以看出，在培养基A5（WPM+ ZT 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L）上，‘北陆’‘斯巴坦’两个蓝莓品种叶片再生效果最佳，‘北陆’叶片再生率达93.5%，‘斯巴坦’再生率达到89.8%，‘北陆’再生效果优于‘斯巴坦’；在培养基A9（WPM+ ZT 2.0 mg/L +IAA 0.4 mg/L）上，两个品种叶片再生效果均最差，也是‘北陆’再生效果优于‘斯巴坦’。这可能与品种的基因型有关，‘北陆’在生产应用中较‘斯巴坦’适应性强、抗逆性强，有更广泛的栽培区域。

表3 不同激素浓度培养基对蓝莓试管苗生长发育的影响 %

3.2 pH 值和琼脂浓度对叶片再生的影响

随着pH 值的升高，不同品种叶片在同一pH 值下及同一品种的叶片在不同pH 值下的叶色、愈伤组织、再生芽数等均不同，再生时间为发现肉眼可见再生芽的平均记录时间。

由表4可以看出，‘北陆’ 在不同pH 值条件下，生长情况不同，pH 值为5.0 时株高、新生芽数均显著优于其他处理，再生率最高（96.5%），再生时间短(37.7 d)，叶色绿；其次为pH 值为4.5 的；再次为pH 值为4.0 的。效果最差的为pH 值6.5，pH 值5.5 和6.0 的也不好。说明蓝莓适宜酸性环境。‘北陆’最适宜的培养基pH 值为5.0。同理，‘斯巴坦’培养基的最适pH 值为4.5。可见，培养基pH 值是影响蓝莓叶片再生效果的关键因素，适宜的培养基pH 值可以增加叶片再生率。A5 培养基制好后的原始pH 值为5.2，可以直接用作‘北陆’的叶片再生培养基；用在‘斯巴坦’上则需要用酸调节pH 值到4.5，否则影响再生效果。

两个品种的适宜琼脂浓度分别为5.0 g/L和6.5 g/L。

表4 培养基中不同pH 值为对蓝莓离体叶片再生的影响

3.3 不同叶片处理对再生的影响

由表5可知，各叶片创伤处理形式对蓝莓叶片再生影响不大，在进行蓝莓叶片再生时，可以任意对蓝莓叶片进行创伤，且不限叶片摆放形式。叶两端创伤产生的愈伤组织较多，再生植株也较多，后期生长养分供应不足，植株黄化早、明显；生根培养时因为再生植株多、紧密，分株相对比较困难。叶尖端创伤方式容易从叶柄处形成愈伤组织并产生再生植株，而并非叶片离体再生。

表5 不同叶片处理方式对蓝莓叶片再生的影响

3.4 暗培养对叶片再生的影响

由表6可知，各暗处理时间对蓝莓叶片再生影响不大，在蓝莓叶片再生试验过程中可以不进行暗培养。

表6 不同暗培养时间对蓝莓叶片再生的影响

4 讨论

本文以北高丛蓝莓品种‘斯巴坦’和半高丛蓝莓品种‘北陆’的试管苗叶片为外植体，通过对培养基中不同激素种类及其浓度配比、不同pH 值、叶片处理方式及暗培养对离体叶片再生影响进行研究，建立了北高丛蓝莓‘斯巴坦’和半高丛蓝莓‘北陆’植株叶片再生体系，为进一步工厂化生产奠定了基础。

在基本培养基方面，根据马怀宇等[4]对高丛蓝莓离体叶片再生研究，本试验选择最适合高丛蓝莓叶片再生的WPM 培养基。在激素及其配比方面，本研究结果表明，1.5 mg/L ZT +0.3 mg/L IAA 诱导愈伤组织效果最佳，其中‘北陆’再生率达到最高93.5%而‘斯巴坦’再生率达到最高89.8%。这与马怀宇等[4]在高丛蓝莓离体叶片再生研究结果比较一致。培养基pH 值的研究结果表明，最适合‘斯巴坦’叶片再生的培养基pH 值为4.5，最适合‘北陆’叶片再生的pH 值为5.0。当pH 值过高或过低时，再生率降低，愈伤组织形成的少或无，叶片发黄或最后枯萎。本研究在叶片放置方式和暗培养方面对两个品种蓝莓离体叶片再生影响不大，这与相关文献报道中的结果不同[5,6]，还有待于进一步研究。