链球菌噬菌体的分离及其研究

■ 秦生巨戚太海张连水罗霞

（1南京巨豹生物工程有限公司 2沧州旺发生物技术研究所有限公司 3中国水产科学研究院珠江水产研究所）

链球菌噬菌体的分离及其研究

■ 秦生巨1戚太海1张连水2罗霞3

（1南京巨豹生物工程有限公司 2沧州旺发生物技术研究所有限公司 3中国水产科学研究院珠江水产研究所）

噬菌体是一类细菌特异性的病毒，它有典型的病毒形态和结构。噬菌体对宿主有高度的特异性。噬菌体的作用方式，是以尾鞘吸附到宿主细胞特定的受点上，向菌体内注射RNA，并在菌体内复制子代，最终溶解宿主的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主内生长繁殖。

罗非鱼，是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。通常生活于淡水中，也能生活于不同盐份含量的咸水中，也可以存活于湖，河，池塘的浅水中。它有很强的适应能力，在面积狭小之水域中亦能繁殖，甚至在水稻田里能够生长，且对溶氧较少之水有极强之适应性。绝大部分罗非鱼是杂食性，常吃水中植物和碎物。

链球菌是化脓性球菌的另一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便，健康人鼻咽部，大多数不致病。医学上重要的链球菌主要有化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌等。引起人类的疾病主要有化脓性炎症、毒素性疾病和超敏反应性疾病等。

罗非鱼链球菌病是2009年发生在广东、广西、海南3省的一种鱼类疾病。网箱和池塘养殖的罗非鱼均有此病的发生，主要危害亲鱼和100g以上的幼鱼和成鱼；流行高发期为5～9月份；流行水温为25℃～37℃，在水温32℃以上容易发病，且传染性强，发病率达20%～30%，发病鱼的死亡率可达80%以上。

表1 不同温度对链球菌噬菌体形成噬菌斑活力的影响

表2 3株噬菌体于不同来源的链球菌株上形成噬菌斑能力的测定

表3 不同保存方法对噬菌体HN48/SS130920存活时间的影响

近年来国内许多同行都在探索罗非鱼链球菌病的防治方法，但国内外尚未发现用噬菌体防治罗非鱼链球菌病的报导。2015年我们在海南省做了罗非鱼养殖水体及罗非鱼体内链球菌噬菌体的分离检测。本文是对此次分离、纯化的链球菌噬菌体的初步研究结果的报导。

1 材料与方法

1.1 培养基

胨肉膏液：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加蒸馏水到1,000mL，调整pH到7.4。固体培养基：上述胨肉膏液加1.2%琼脂粉。半固体培养基：上述胨肉膏液加0.7%琼脂粉。软琼脂培养基：上述胨肉膏液加0.3%琼脂粉。0.85%生理盐水：NaCl8.5g，加蒸馏水到1,000mL，调整pH到7.4。

1.2 宿主菌株

用于检查、分离、培养链球菌噬菌体及其检查其宿主范围的链球菌株为本公司及中国水产科学研究院珠江水产研究所保存者。

1.3 检测样本

用于检测的水体和罗非鱼样本来自海南省海口市郊区桂林洋和文昌市大致坡。

1.4 噬菌体噬菌斑的检测、计数

幼稚宿主菌悬液的制备：将保存获得的链球菌在胨肉膏固体培养基平板上划线分离，于37℃培养18～24h，取典型的菌落图片，革兰氏染色镜检，可见典型的链球菌形态。取典型的菌落接种到胨肉膏液中，于37℃培养4～6h备用。双层琼脂法。

1.5 链球菌噬菌体的检出、分离、纯化与培养

采集的新鲜水样450mL，加10倍浓缩的胨肉膏液50mL，加幼稚宿主菌悬液2mL于37℃培养过夜。采集的罗非鱼样品取其鱼的内脏10～15g加到500mL的胨肉膏液中，同时加2mL幼稚宿主菌悬液，于37℃培养过夜。取培养过夜的样品上清液10mL，12,000prm取上清液，于56℃水浴培养1h，取上清液0.5mL以链球菌幼稚菌悬液0.2mL为宿主，用双层琼脂平板法检查噬菌斑的形成。有透明的噬菌斑的形成即可判定有噬菌体的检出为阳性，未见有透明的噬菌斑的形成即可判定噬菌体的检出为阴性。分离、纯化、培养。

1.6 链球菌噬菌体的保存

图1 噬菌斑

将分离获得的噬菌体H N 4 8/SS130920制成上清液，用以下不同的方法和条件保存。

胨肉膏液：于100mL胨肉膏液中加噬菌体上清液2mL；软琼脂：于10mL胨肉膏软琼脂中加噬菌体上清液0.5mL；半固体琼脂：于10mL胨肉膏半固体琼脂中加噬菌体上清液0.5mL；于自来水液中加含量大约为105/pfu噬菌体。以上4种方法都同时平行做2组，一组加链球菌幼稚菌液，使其浓度大约为106/cfu。另一组不加链球菌幼稚菌液。4种方法每组做3管。然后加有链球菌幼稚菌液和不加链球菌幼稚菌液的保藏物，分别放置于4℃、37℃及室温（南京市的2015年9月到2016年8月）保存，并检查存活时间。

2 结果

2.1 噬菌体的检出、分离结果及菌株的检查

2015年7～9月及2016年9～10月于海南省文昌市和海口市6处采集海、淡水样79份，罗非鱼样品3份，共计82份样品。其中检出在链球菌宿主上能形成噬菌斑的5份（3.79%），其中淡水检查3份，海水2份，罗非鱼样品没有检出噬菌斑。有5份阳性结果经噬菌斑纯化得到3株（HN48/SS130920、HN58/SS130920、HN74/SS130920、）无杂菌生长的噬菌体株，对其进一步检查。

其结果为：在胨肉膏双层琼脂培养基平板上，于37℃培养12～18小时形成透明的噬菌斑，噬菌斑的直径1～3mm（见图1）；可使浓厚的宿主菌胨肉膏悬液（20亿/mL）4～6h后裂解透明。

2.2 温度对噬菌斑形成的影响

检查了不同温度对3株噬菌体于胨肉膏双层琼脂培养基平板上形成噬菌斑活力的影响，25℃～40℃16h均可形成噬菌斑。但从已形成噬菌斑活力来看35℃更为合适，20℃及以下、45℃及以上未见噬菌斑的形成。结果见表1。

2.3 于不同的链球菌株上形成噬菌斑能力的测定

检查了3株噬菌体于胨肉膏双层琼脂培养基平板上对不同来源的链球菌形成噬菌斑的能力（宿主范围）。每平板接种噬菌体上清液0.5mL，链球菌宿主菌幼稚培养液0.2mL，37℃培养16h观察结果。结果见表2。

2.4 保存方法及存活时间

检查了噬菌体HN48/SS130920在胨肉膏液、软琼脂、半固体琼脂、自来水中的存活时间；同时检查了加有宿主链球菌幼稚菌液和不加宿主链球菌幼稚菌液对其保存的影响；也观察了在4℃、37℃及室温（南京市的2015年9月到2016年8月）链球菌噬菌体存活时间。结果见表3。

3 讨论

根据噬菌体株的特性这是一类以链球菌为宿主的链球菌噬菌体。据此次调查，养殖罗非鱼的海、淡水体都可分离到此类噬菌体的存在，但含量有限。

噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中，常含有噬菌体。链球菌噬菌体在污染的水源中也不难找到其宿主，尤其是水生物的养殖水源中。25℃～40℃都有裂解活力。在加有宿主菌的胨肉膏液中4℃环境中保存1年以上仍可检出。因此推测在自然环境水体中将可繁衍生存。其存在对链球菌，尤其是罗非鱼链球菌病的病原菌在自然界的生物控制中所起的作用值得进一步探讨。（参考文献略）