室内循环水养殖大黄鱼盾纤毛虫病的病理学分析

杨桂琴，李晓东*，路玮静，姜 璠，陈紫琴，张伟妮，2，陈新华

(1.福建农林大学海洋学院，福建省海洋生物技术重点实验室，海水养殖生物育种全国重点实验室，福建 福州 350002；2.福建农林大学，中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室，福建 福州 350002)

大黄鱼(Larimichthyscrocea)，隶属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys)，肉质鲜美、营养丰富、经济价值高，是中国重要的海水养殖经济鱼类，也是福建省网箱养鱼产量最高的鱼种[1-3]。近年来，随着大黄鱼养殖业的快速发展，其养殖量日益攀升，养殖密度逐渐增大，导致大黄鱼养殖环境遭到严重破坏，进而出现由细菌、病毒和寄生虫引发的疾病频发[4-6]，其中以近年来流行暴发的大黄鱼刺激隐核虫病危害最为广泛，对养殖业造成了巨大经济损失[7-8]。国内外关于刺激隐核虫病的组织病理学已有很多报道，当虫体在宿主中发育时，受侵染的皮肤会形成“白点”，严重感染的个体会出现上皮细胞坏死、脱落的现象，更甚者细胞凋亡、宿主死亡[9-10]。在感染刺激隐核虫病的大黄鱼中发现，患病鱼的各内脏组织器官都有明显的病变特征，包括肝脏充血萎缩、脾脏肿胀、胆囊发炎、肠道内充满了大量的黄白色黏液[11]。

目前，有研究表明海水鱼类体内寄生的纤毛虫大多以盾纤毛虫为主，易感染的鱼类主要是牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthlmusmaximus)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)和鲈鱼(Perchspp.)，该虫病在鱼类育苗期、养成期均可发生，一旦感染，传染速度非常快，发病率极高，会造成鱼类规模性死亡[12-13]。在分离鉴定出的多种盾纤毛虫中，贪食迈阿密虫(Miamiensisavidus)可引起细点牙鲷(Dentexdentex)盾纤毛虫病，患病鱼会出现体表出血、背鳍溃烂、皮肤褪色、大量腹水的现象[14]；由尾丝虫属(Uronemasp.)引起的珊瑚礁鱼盾纤毛虫病，患病鱼的骨骼肌发炎、皮肤及鳃细胞坏死[15]；由蟹栖异阿脑虫(Mesanophryscarcini)引起的养殖大菱鲆盾纤毛虫病，患病鱼的病灶部位变白、浮肿，病鱼组织出现多处明显病变[16]。然而在大黄鱼体表寄生的盾纤毛虫病的病理学分析鲜有报道，因此本研究通过对自然患病大黄鱼与正常大黄鱼的组织病理变化进行比较研究，分离出盾纤毛虫病原体，对其进行形态特征分析，探讨大黄鱼盾纤毛虫病的病理过程和发病机理，同时初步分析并推测盾纤毛虫的分属地位，为海水鱼类在室内循环水养殖出现的盾纤毛虫病的预防及诊断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验用大黄鱼体质量为(7.0±2.5)g，购自福建省罗源县泽洋水产有限公司，均为海水养殖网箱中健康人工繁育个体，采用实验室内循环水养殖系统进行饲养，养殖环境温度为(19±1)℃。在适应性养殖第3天开始，个别大黄鱼体表出现小白点，之后逐渐形成白斑。经检查选取健康大黄鱼与患病鱼进行实验。

1.2 虫体培养

盾纤毛虫培养液制备：剪取5.0 g大黄鱼肉，充分研磨糜烂后，加入适量的蒸馏水，用经0.45 μm混合纤维滤膜过滤的海水与研磨的鱼肉混匀后再进行高温高压灭菌处理，待冷却后，先用纱布滤除多余的肉渣，再用0.45 μm混合纤维滤膜过滤肉汤，将10 mL过滤的肉汤加入100 mL过滤的海水中，形成的海水肉汤培养基即为盾纤毛虫培养液。

实验所用的纤毛虫分离自患病大黄鱼体表发白溃烂处，将分离得到的虫体接种于海水肉汤培养基中进行驯化培养。在肉汤培养状态下，虫体游动极其活跃，喜在组织碎屑中聚集，并通过体前端的尖顶在基质中钻营；单个虫体在2～3 d内可通过二分裂快速繁殖形成高密度的虫体群。

1.3 实验方法

1.3.1 解剖观察

活体解剖濒死大黄鱼，用肉眼和解剖镜观察患病鱼体表及其内脏组织病变情况，并与健康大黄鱼作比较，以确定该病的主要病变情况及病变部位，再以此为依据合理选择组织切片的病理材料。

1.3.2 寄生虫检查

将患病大黄鱼体表黏液、鳍条、鳃片、病灶溃烂部位的深层组织制成水浸片进行镜检，挑取少量肝脏、脾脏、肠道进行压片检查。

1.3.3 光镜样品制备及观察

用解剖剪、镊子分别取患病大黄鱼和健康大黄鱼的鳃、肝脏、脾脏、肠、肌肉、皮肤 6 种组织。先用10%多聚甲醛固定24 h，经过70%乙醇清洗数次，再用70%～100%乙醇逐级脱水45～60 min，然后用二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机切片，HE染色，中性树胶封片，最后显微镜下观察并拍照保存。

1.3.4 盾纤毛虫的形态观察

多聚甲醛固定观察：吸取1 mL虫液加至1.5 mL EP离心管中，吸取少量体积分数为10%多聚甲醛溶液滴入离心管中，摇匀灭活之后，从中吸取虫液滴在干净载玻片上，并缓慢盖上盖玻片，由低倍镜到高倍镜依次观察并拍照记录保存。

扫描电镜观察：将需要制样的虫体离心(3 000 r/min、5 min)后，用体积分数为2.5%的戊二醛电镜固定液固定5 min以上，采取王印庚等[17]研究的步骤进行制片，并用扫描电镜观察及拍照记录保存。

2 结果与分析

2.1 解剖观察与发病症状

在实验室适应性养殖过程中，前3 d未发现大黄鱼体表出现明显的病变特征，第4天时在鱼体表及鳍条可见颗粒状的小白点，患病鱼静卧池底或在出水口边缘缓慢游动，体色变暗，摄食减少，活力下降，黏液增多。在养殖5～6 d时，部分大黄鱼眼睛白浊、鳃盖充血，严重时体表或头部皮肤组织呈块状发白溃烂，皮下组织肌肉发红，表皮病灶多有浮肿现象，鱼体失去皮肤的屏障保护，导致盾纤毛虫侵染入更深层组织，使死亡的大黄鱼只剩下一层白膜。同时镜检体表病灶部位发现大量盾纤毛虫寄生；剖检后未见内脏器官病变和寄生虫(图1)。健康鱼一经感染，几乎全部死亡。

注：图中红色圆圈代表大黄鱼病变组织。a.头部发白；b.体表局部块状泛白，鳃盖充血；c.背鳍发白；d.剖检，上为健康大黄鱼，下为患病大黄鱼。Notes：The red circle in the picture represented the diseased tissue of L.crocea. a. Head whitening；b. Local massive whitening of the body surface，gill cover hyperemia；c. Whitening of the dorsal fin；d. Autopsy showed healthy L.crocea at the top and diseased L.crocea at the bottom.

2.2 组织病理

与健康大黄鱼相比，患病大黄鱼的体表、肝脏、肌肉组织均表现出明显的组织病理变化；而鱼鳃、脾脏、肠道等组织未发现明显病变，因此未将图片列出。

2.2.1 体表皮肤及皮下组织

大黄鱼病灶多发于头部、鳍基部和体表皮肤。从图2患病鱼皮肤组织和体表黏液镜检中明显观察到有盾纤毛虫的寄生。不仅盾纤毛虫的寄生会造成鱼体组织水肿，而且其大量繁殖也会使感染的组织体积扩大，导致表皮病灶处多伴随有浮肿现象的发生，从而引发组织坏死，大部分组织空间被盾纤毛虫占据(图2c)，使细胞核出现固缩、碎裂、细胞溶解，组织变性、溃散、坏死，结缔组织炎性细胞增多。

注：图中箭头代表盾纤毛虫。a. 健康鱼；b. 患病鱼；c. 4倍显微镜下的体表黏液盾纤毛虫。Notes：The arrow in the picture represented the scuticociliatida. a. Healthy fish；b. Sick fish；c.Scuticociliatida on the body surface under a 4X microscope.

2.2.2 肝脏

如图3所示，健康大黄鱼近似椭圆的多角形细胞为实质细胞，以放射性排列向四周扩散，部分胰脏组织嵌入肝组织中，经HE染色呈紫蓝色的为胰腺细胞间结缔组织，其呈现出较强的嗜碱性。在患病大黄鱼肝脏中未发现寄生的纤毛虫，发生明显的组织变化是肝脏细胞增生，细胞之间的界限不明显，中央静脉被压迫，单核细胞增多，实质细胞变大，结缔组织的嗜碱性减弱。

注：a. 健康鱼；b. 患病鱼。Notes：a.Healthy fish；b.Sick fish.

2.2.3 肌肉

如图4所示，健康大黄鱼肌肉组织中肌细胞排列紧密、条纹清晰，细胞核位于细胞边缘。患病大黄鱼肌细胞着色不均匀，大部分区域浆溶解，肌原纤维明显断裂、弯曲不齐，肌纤维间隙增大。

注：a. 健康鱼；b. 患病鱼。Notes：a.Healthy fish；b. Sick fish.

2.3 盾纤毛虫的形态学

由图5可知，虫体外形为饱满的水滴状，皮膜薄而无缺刻，顶端略尖，常向后背弯曲，后端浑圆，周身长有纤毛，体排列稀疏；虫体大小约(20～35)μm×(10～20)μm，体内具有多个2～5 μm 的圆形食物泡，细胞质无色，显微镜下可见位于中央区的不透明大核，呈圆形，体后端含有一个透明的伸缩泡和一根长鞭毛。通过活体甲醛国定显微镜及扫描电镜观察，初步分析及推测该盾纤毛虫可能为水滴伪康纤虫(Pseudocohnilembuspersalinus)。

注：a. 甲醛固定显微镜观察；b. 扫描电镜观察；c. 盾纤毛虫形态裂解过程。Notes：a. Formaldehyde fixed microscope；b. Scanning electron microscope；c. Morphological cleavage process of Scuticociliatida.

将肉汤培养基与盾纤毛虫混合连续培养，显微镜观察发现盾纤毛虫的运动明显变缓慢，而且出现盾纤毛虫原地打转的现象。当培养2 d(图5c-1)、3 d(图5c-2)、4 d(图5c-3)、5 d(图5c-4)后，盾纤毛虫逐渐表现出运动缓慢且形态变形、开始裂解的现象。培养时间越长，虫体裂解程度越大，直至虫体结构完全裂解，胞质流出。连续培养过程中盾纤毛虫裂解形态变化如图5c(1～4)所示。

3 讨论

大黄鱼是福建省重要的海水养殖鱼类，其寄生虫病害主要有刺激隐核虫病[18]和单殖吸虫类本尼登虫病[19]，也有寄生于大黄鱼的拟格拉夫涡虫病[20]，而关于大黄鱼体内感染寄生盾纤毛虫致病死亡的报道鲜有。通常感染盾纤毛虫病的鱼类有牙鲆、大菱鲆、真鲷(Pagrusmajor)、花鲈(Lateolabraxmaculatus)、金枪鱼(Thunnusspp.)、红鳍东方鲀等海水鱼类，一旦感染，均会造成严重的危害[12-13，21]。张善霹[8]首次报道了大黄鱼因体表溃烂而大量死亡，并从体表病灶部分和内脏观察到大量盾纤毛虫。在相关研究[22]中，受到盾纤毛虫感染的鱼类通常会出现体表黏液增多现象，并附着分布不规则的白色块状絮团，患病鱼消瘦、活力下降、易打圈式游动，摄食量降低甚至绝食，这和本研究患病大黄鱼出现的症状一致。患病严重的鱼类体表和鳍基部会发红或糜烂，鱼鳃出血褪色、鳃盖内侧红肿，皮肤和皮下肌肉组织出血或坏死性溃疡，此外有的病鱼肝脏出血或糜烂，脾脏淤血、肿大，肠道松弛，腹腔积水，体内和体表病灶处均出现大量寄生的盾纤毛虫[22-23]，这表明盾纤毛虫没有明显的宿主选择性。在本研究中同样发现患病大黄鱼皮肤及皮下组织严重溃烂，鳃盖发白充血，肌肉组织大部分区域的肌浆溶解，肌原纤维明显断裂、弯曲不齐，肌纤维间隙增大，肝脏组织中肝细胞增生，单核细胞增多，实质细胞变大，结缔组织的嗜碱性减弱；但仅有体表病灶处发现寄生的盾纤毛虫，体内组织未发现明显病变和盾纤毛虫。本实验大黄鱼感染盾纤毛虫的主要部位是体表，可能是在购买鱼苗时，人员的挑选、搬动导致了机体损伤，而在伤口尚未愈合时，运输造成的应激反应和实验室循环水的饲养使盾纤毛虫侵入大黄鱼体表受损部位、水质被污染，进而造成盾纤毛虫传染性的传播。本次大黄鱼病害病程短，表明该虫拥有极强的繁殖力、传染性，应引起实验室循环水养殖大黄鱼者的广泛关注。

盾纤毛虫病是室内工厂化养殖和海上网箱养殖鱼类常见的体内寄生的纤毛虫疾病，其主要在小鱼、中等大小的鱼中发病，且鱼体规格越小，发病率越高，有调查显示盾纤毛虫病在小于10 cm鱼的总发病率约为86.4%，常见发生于鲆鲽鱼、鲷鲈鱼、金枪鱼、红鳍东方鲀等养殖鱼类，对养殖业造成极其严重的经济损失。盾纤毛虫疾病的病原体主要有海洋尾丝虫(Uronemamarinum)、暗尾丝虫(Uronemanigricans)、舌齿鲈嗜污虫(Philasteridesdicentrarchi)、高盐拟康纤虫(Pseudocohnilembuspersalinus)、水滴伪康纤虫、贪食迈阿密虫、指状拟舟虫(Paralembusdigitiformis)、喙突拟梭虫(Paralembusrostratus)、蟹栖异阿脑虫、巨大拟阿脑虫(Paranophysmagna)等[13]。本次发现寄生于大黄鱼体表的盾纤毛虫病原体经形态学初步鉴定为水滴伪康纤虫，但还需使用分子学方法进行进一步的探究。