三角帆蚌四个颜色选育系贝壳珍珠层颜色与外壳色的相关性分析

罗 雨，张文府，任 岗，程霄玲，方爱萍，叶容晖，张文娜，安显博，张根芳*

(1.金华职业技术学院，浙江 金华 321017；2.金华市动物健康养殖高新技术研发中心，浙江 金华 321017；3.绍兴文理学院，浙江 绍兴 312000；4.金华水产技术推广站，浙江 金华 321017；5.金华市威旺养殖新技术有限公司，浙江 金华 321017；6.东明县马头镇初级中学，山东 菏泽 274000；7.东明县马头镇中心学校，山东 菏泽 274000)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是中国最主要的淡水珍珠育珠蚌，近十年来其平均年珍珠产量超过1 000 t。珍珠颜色是评价珍珠质量的一项重要指标，在自然状态下，淡水珍珠颜色为深浅不一的紫色、粉色、金色、白色等多种色系[1]。据统计，中国淡水珍珠产量占全球总产量的90%以上，但销售额不超过全球珍珠总销售额的5%，其主要原因是中国90%以上的淡水珍珠颜色为杂色，白色、紫色等纯色珍珠极为稀少。因此，迫切需要培育颜色纯正、色泽均匀统一的淡水珍珠，以提高中国珍珠在国际市场上的竞争力。

前期研究表明，三角帆蚌贝壳珍珠层颜色受遗传基因控制，属质量性状，可以稳定遗传[2]。另外，海水珍珠和淡水珍珠均已被证明其珍珠的颜色与制片蚌珍珠层颜色保持一致，也都由制片蚌外套膜的分泌特性所决定[3-8]。因此，培育颜色均一的淡水珍珠需要选育具有特定贝壳珍珠层颜色的制片蚌。经过多年努力，已有红色、蓝色、金色和白色等4种珍珠层颜色选育系的制片蚌被培育出来。然而，在进行珍珠层颜色选育时，需要撬开三角帆蚌腹缘双壳进行观察，这不仅工作量大，而且容易导致蚌的损伤甚至死亡，对选育的进程和效果造成不利的影响。本团队前期研究发现，可以通过观察外壳色间接判断珍珠层颜色，并证实了紫色和白色三角帆蚌外壳色与珍珠层颜色有一定的关联性[9]。因此，本研究以选育的红色、蓝色、金色和白色三角帆蚌选育系为研究对象，进一步分析三角帆蚌珍珠层颜色参数与外壳颜色参数的相关性，同时通过方差分析、主成分分析对4个选育系之间珍珠层颜色、外壳颜色的差异进行分析并可视化，旨在为三角帆蚌珍珠层颜色性状的间接选择提供参考，以及为珍珠层颜色无损和高效选育提供理论基础和实践指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为金华市威旺养殖新技术有限公司养殖基地(国家级三角帆蚌良种场)的以珍珠层颜色为选育性状并连续进行4代群体选育获得的红色、蓝色、金色和白色三角帆蚌选育系。8～12月龄三角帆蚌壳长、壳宽、壳高等生长性状处于平台期[10]，该月龄段的蚌常被挑选作为制片蚌并开始插核手术以培育珍珠。同时，该阶段的幼蚌贝壳已逐渐发育成为不透明状态，外壳、珍珠层、棱柱层达2～3 mm，外壳色清晰。另外，一般情况下三角帆蚌在12月龄之前是养殖在加有营养泥的小网箱(40 cm×40 cm×12 cm)中，12月龄之后需要从小网箱中取出并分养至网袋中，导致外壳色因养殖环境的变化而发生改变。因此，本试验选用蚌的规格为壳长7～8 cm的12月龄蚌。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法

分别随机选取12月龄红色、蓝色、金色和白色三角帆蚌选育系(图1)50只以上。清理蚌壳表面的污物后切断三角帆蚌前后闭壳肌，去除内脏团及外套膜，清除蚌壳内表面的黏液，用清水洗净后干燥，备测。干燥时避免阳光直射，以免对珍珠层颜色造成影响。

1.2.2 颜色测量方法

采用美国爱色丽ColorEye XTH色差仪(X.rite-Spectrophotometer)对珍珠层和外壳颜色数据进行测量，以获取颜色参数L、a和b值(CIE1976)。 CIELab 颜色空间是利用 L、 a、 b三个不同的坐标轴，指示颜色在几何坐标图中的位置，其中 L轴表示明度，黑度在底端，白度在顶端；+a表示红色，-a表示绿色；+b表示黄色，-b表示蓝色。

1.2.3 测量位点的选取

培育珍珠的颜色与制片蚌珍珠层颜色保持一致。进行珍珠插片移植手术时，移植对象(组织小片)主要来源于制片蚌外套膜边缘组织。另外，外套膜不同区域珍珠层颜色也有细微的差异[11]。因此，为尽量获得整体外壳色代表性数据，外壳色的测量选取了前部、中部、后部和背部4个位点(图2 a)；珍珠层颜色的测量选取距离腹缘0.8～1.2 cm处前部、中部和后部3个位点(图2b)，测量位点尽量筛选表面色泽均匀且较光滑的区域，避开凹凸不平和瑕疵。

1.3 数据处理与分析

为了使数据更具有代表性，将每个蚌体珍珠层前部、中部和后部3个位点颜色参数的均值作为样本珍珠层颜色的估计值，外壳前部、中部、后部和背部4个位点颜色参数的均值作为样本外壳色的估计值。

采用IBM SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，计算珍珠层与外壳各颜色参数的Pearson相关系数，并对其进行显著性检验(双侧)。以外壳各颜色参数作为自变量、珍珠层各颜色参数作为因变量，运用逐步回归剔除偏回归系数不显著的颜色参数，建立珍珠层颜色对外壳各颜色参数的回归方程；为了对四个选育系之间珍珠层颜色、外壳颜色差异进行可视化分析，利用主成分分析法分别提取3个珍珠层颜色参数、3个外壳颜色参数中无相关关系的2个主成分，并采用SYSTAT 13.0统计软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 四个三角帆蚌选育系珍珠层与外壳各颜色参数的统计量及方差分析

对4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色参数的统计量见表1，由表中数据可知，白色选育系的L值最大，为72.79，说明白色选育系的珍珠层颜色亮度最好；与其他3个颜色选育系相比，白色选育系的a值和b值均较小，更加趋向于非彩色。金色选育系的b值最大，为8.45，b值越大表明颜色越趋向于金色，表明金色选育系珍珠层颜色最黄。红色选育系的a值最大，a值越大表明颜色越趋向于红色。蓝色选育系的b值最大，b值越大表明颜色越趋向于蓝色。

表1 四个三角帆蚌选育系珍珠层颜色参数的统计量Tab.1 Nacre color parameter statistics of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

对4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色参数进行方差分析，结果见表2。由表2可知，各颜色参数在不同选育系之间具有极显著差异(P<0.01)。

表2 四个三角帆蚌选育系珍珠层颜色参数的方差分Tab.2 Analysis of variance of the nacre color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.2 四个三角帆蚌选育系珍珠层颜色的主成分分析

分别对4个三角帆蚌选育系珍珠层的3个颜色参数进行主成分分析，获得了主成分1(PC1)和主成分2(PC2)。2个主成分的累积贡献率为88.40%，贡献率较高，说明其可解释总变异的绝大部分，表明提取的2个主成分足以概括4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色的差异。图3为4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色PC1和PC2的散布图，可以看出，白色选育系与其他3个选育系的珍珠层颜色之间几乎没有重叠，表明白色选育系珍珠层颜色的量化数据与其他3个选育系之间差异较大。金色、红色及蓝色选育系三者之间均有重叠，其中金色与蓝色选育系重叠区域最小，红色与蓝色选育系大部分重叠，表明金色与蓝色选育系珍珠层颜色有一定的相似性，而红色和蓝色选育系珍珠层颜色相似性较高。

2.3 四个三角帆蚌选育系外壳色颜色参数的统计量及方差分析

对4个三角帆蚌选育系外壳色各颜色参数的统计量见表3，由表中数据可知，相对于珍珠层颜色，4个三角帆蚌选育系外壳色的L值较小，即其明亮度较低；a和b值均较大，表明4个三角帆蚌选育系外壳的颜色较为丰富。

表3 四个三角帆蚌选育系外壳颜色参数统计量Tab.3 Shell color parameter statistics of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

对4个三角帆蚌选育系外壳各颜色参数进行方差分析，结果见表4。由表4可知，外壳各颜色参数在不同选育系之间具有极显著差异(P<0.01)。

表4 四个三角帆蚌选育系外壳颜色参数的方差分析Tab.4 Analysis of variance of the shell color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.4 四个三角帆蚌选育系外壳色的主成分分析

分别对4个三角帆蚌选育系外壳色的3个颜色参数进行主成分分析，获得了PC1和PC2。2个主成分的累积贡献率为93.93%，贡献率较高，说明其可解释总变异的绝大部分，表明提取的2个主成分足以概括4个三角帆蚌选育系外壳色的差异。4个三角帆蚌选育系外壳色PC1和PC2的散布如图4所示，可以看出，4个三角帆蚌选育系外壳色皆有重叠，其中红色与蓝色选育系外壳色重叠度最高，说明二者外壳色较为相似；金色与白色选育系外壳色重叠度相对最低，表明二者外壳色差异在4种颜色选育系中相对容易被区分。

2.5 四个三角帆蚌选育系珍珠层颜色与外壳色的相关性分析

4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色与外壳色的相关性分析结果见表5。红色选育系珍珠层颜色的L值与外壳色的L值极显著相关(P<0.01)、a值显著相关(P<0.05)，相关系数r分别为0.314和-0.268；珍珠层颜色的a值与外壳色的L值显著相关(P<0.05)、a值及b值极显著相关(P<0.01)，相关系数r分别为0.273、-0.502和-0.557；珍珠层颜色的b值与外壳色的b值极显著相关(P<0.01)，相关系数r为-0.319。蓝色选育系珍珠层颜色的L值和外壳色的L值与a值都极显著相关(P<0.01)，相关系数r分别为0.533和-0.410；珍珠层颜色的a值与外壳色的L值及b值均极显著相关(P<0.01)，相关系数r分别为0.419和-0.390；珍珠层颜色的b值与外壳色的L值显著相关(P<0.05)，相关系数r为0.261。金色选育系珍珠层颜色a值、b值均与外壳色L值显著相关(P<0.05)，相关系数r分别为0.331和0.335。白色选育系珍珠层颜色a值与外壳色a值极显著相关(P<0.01)，相关系数r为0.286。

表5 四个三角帆蚌选育系珍珠层和外壳各颜色参数的相关性Tab.5 Correlation of color parameters of nacre and shell colors in the four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.6 四个三角帆蚌选育系珍珠层颜色和外壳色的回归分析

运用逐步回归分析法，以珍珠层颜色参数为因变量、外壳颜色参数为自变量，对4个三角帆蚌选育系珍珠层和外壳各颜色参数进行回归分析(表6)。通过逐步回归分析剔除不显著的偏回归系数，红色选育系和蓝色选育系珍珠层的3个颜色参数L、a和b皆与外壳颜色参数成功建立回归方程；金色选育系只有珍珠层颜色参数 a和b与外壳颜色参数成功建立回归方程；白色选育系珍珠层只有颜色参数 a与外壳颜色参数成功建立回归方程。根据表6中数据，可以构建珍珠层颜色参数和外壳颜色参数间的回归方程，例如红色选育系珍珠层颜色参数(L-内、a-内、b-内)分别与外壳颜色参数(L-外、a-外、b-外)的回归方程为：

表6 四个三角帆蚌选育系珍珠层和外壳各颜色参数的回归分析Tab.6 Regression analysis of the nacre and shell color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

L-内=55.734-1.048×a-外+0.870×b-外；

a-内=-1.767+0.338×L-外+0.182×a-外-0.470×b-外；

b-内=7.927-0.233×b-外。

3 讨论

CIE Lab是国际通用的均匀颜色模型，因基于人眼生理特征并不受设备影响[12]，近年来被广泛用于贝类外壳色和珍珠层颜色数据的定量测定[13-14]。本研究运用色差仪对红色、蓝色、金色和白色4个三角帆蚌选育系外壳和珍珠层颜色数据进行测量并量化，运用主成分分析法对不同三角帆蚌选育系外壳色和珍珠层颜色进行了对比，并分别对4个三角帆蚌选育系外壳和珍珠层各颜色参数的相关性进行了分析。

3.1 三角帆蚌不同选育系间珍珠层颜色、外壳色的差异性

主成分分析方法已经在水产领域得到了广泛的应用[15-18]。本文运用主成分分析法对三角帆蚌不同选育系珍珠颜色、外壳色进行了主成分分析，结果表明，红色、蓝色、金色和白色4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色经过选育，已经基本上可以被相互区分开来，差异也较为明显；4个三角帆蚌选育系的外壳色也具有差异，但是其差异没有珍珠层颜色明显。软体动物贝壳分三层，最外层是由壳角蛋白构成的角质层，中间是由方解石构成的棱柱层，内层是由文石和蛋白质、几丁质构成的珍珠层[19]。尽管这三层结构均主要由外套膜分泌形成，但由于角质层薄而且未矿化，因此其对应的外壳色更容易受到环境的影响。研究表明，多种海水贝类的贝壳颜色易受温度、光照、食物等环境因素的调节[20]。本试验中，对于珍珠层颜色，4个三角帆蚌选育系的外壳色相互重叠度更高，这可能是长期处于同一养殖水体导致的外壳色趋于同化。但值得注意的是，色差仪从4个三角帆蚌选育系外壳获得的颜色数据并没有像肉眼观察到的能被明显地区分，这可能是由于肉眼颜色评价是对外壳颜色性状的整体评价，而色差仪所获得的颜色数据是基于4个测量位点的，不能全面反映外壳颜色性状。近年来，国内外已经开始对3D物体颜色测量进行探索[21-22]，若未来开发出针对多位点高通量或者物体3D颜色测量和分析的工具，则有利于贝类壳色的全面、整体评价。

3.2 三角帆蚌不同选育系珍珠层颜色与外壳色的相关性

三角帆蚌外壳和珍珠层各颜色参数相关分析结果表明，4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色与外壳色皆显著相关，这与前期在三角帆蚌白色和紫色选育系中的研究结果[2]相似。在所有颜色相关数据中，红色选育系中珍珠层颜色的a值与外壳色的b值相关性最强，相关系数r为-0.557。另外，红色选育系中珍珠层颜色的a值与外壳色的a值呈现显著的负相关(相关系数r为-0.502)。由于b 值代表蓝黄轴上颜色的饱和度，正值表示黄色，b 值越大，则黄色色度越强；a 值代表绿红轴上颜色的饱和度，正值表示红色，a值越大，则红色色度越强。因此，本研究结果表明，利用三角帆蚌外壳色挑选珍珠层红色选育系时，应尽量剔除外壳呈现黄色系的个体。另外，该结果还暗示，若要通过外壳色间接筛选珍珠层呈明显红色的个体，则其外壳色的红色色度不宜过深，即a值不宜过大。值得一提的是，在蓝色、金色和白色三角帆蚌选育系中也都发现了类似于红色选育系中对应和/或非对应颜色参数具有相关性的现象，例如蓝色选育系中外壳色的L值与珍珠层颜色的L值和a值均显著相关。基于CIE Lab颜色模型对海水珍珠贝的研究发现，外壳色和珍珠层颜色的相关性既存在于对应颜色参数，也存在于非对应颜色参数间[23]。这些结果表明，在CIE Lab颜色模型下，利用外壳色选育特定珍珠层颜色，既需要对应颜色参数的直接评价，也需要非对应颜色参数的间接筛选。

本研究还发现，相对于金色、白色选育系，红色、蓝色选育系珍珠层颜色与外壳色的相关性更强一些。有研究表明，在5～8月龄间，紫色三角帆蚌颜色参数a值和b值随着月龄的增大，逐渐向a>0和b<0的方向发展，使红色和蓝色色度逐渐加深[24]。因此，推测以紫色选育系分离选育而来的红色和蓝色选育系利用外壳色间接评价珍珠层颜色的最佳时期应选择在8月龄以后。本研究团队发现，白色和金色2个浅色选育系在幼龄期的外壳色(白色和金色)受环境影响较小。考虑到三角帆蚌早期选择对其生长性状的显著作用[25]，开展其珍珠层颜色和外壳色随生长年龄变化的相关性研究，进而根据三角帆蚌不同时期的特点开展颜色、生长等不同性状的分段式选择，将有利于提高育种的效率。

3.3 存在问题与展望

本研究运用逐步回归分析法，以珍珠层颜色参数为因变量、外壳颜色参数为自变量，分别对红色、蓝色、金色和白色4个三角帆蚌选育系珍珠层颜色与外壳色进行了回归分析，建立了珍珠层颜色参数和外壳颜色参数的回归方程，为三角帆蚌珍珠层颜色的间接选择提供参考。但需要注意的是，并非所有的三角帆蚌珍珠层颜色参数和外壳颜色参数都具有相关性。因此，利用珍珠层颜色和外壳色的相关性进行珍珠层颜色选育时，可利用其相关性先对外壳色进行初步筛选，然后再对珍珠层颜色进行精准选择，这样既可以减少育种的工作量，又可以保证挑选的准确性。另外，探索和解析不同年龄阶段贝壳颜色变化规律和成体贝壳色表型的关系，是进一步优化珍珠层颜色早期选育技术和培育高品质制片蚌的关键所在。