小麦茎基腐病拮抗菌发酵条件优化及稳定性评价

张 强，吴利民，李朋燕，赵 娜，户申奥，陆宁海

（河南科技学院 资源与环境学院，河南 新乡 453003）

小麦茎基腐病作为世界性病害，在美国、澳大利亚、意大利等国家和北非、中东等地区均有发生[1]。自2012 年首次在河南省报道以来，小麦茎基腐病已在河南、河北、陕西等麦区普遍发生[2‐5]。受耕作方式及秸秆还田等因素的影响，病原菌在土壤中大量残留，导致小麦茎基腐病逐年加重，进而严重威胁小麦的高产和稳产[5‐6]。多种镰刀菌可以导致小麦茎基腐病的发生，我国小麦茎基腐病的病原菌包括禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、假禾谷镰 刀 菌（F.pseudograminearum）、亚 洲 镰 刀 菌（F.asiaticum）等[7]。目前，河南省小麦产区的主要病原为假禾谷镰刀菌[6]。茎基腐病严重发生后，小麦茎秆中存在毒素积累，无法作为饲料原料，否则会给动物养殖带来风险[8‐9]。由于缺少有效的抗病品种，小麦茎基腐病的防治主要采用化学措施[5，9]。与化学防治相比，对环境友好的生物防治也成为防治小麦茎基腐病的重要方式[10]。

目前，生物防治微生物中研究较为广泛的为芽孢杆菌，芽孢杆菌在自然界中普遍存在，很多类群都具有抑制植物病原菌的能力。其中的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）可以产生多种抗菌物质，具有有效抑制多种病原菌的活性[11]。HU等[12]研究发现，解淀粉芽孢杆菌LYZ69 产生的脂肽类物质可以诱导苜蓿炭疽病菌菌丝中活性氧的积累，从而导致病原菌细胞出现死亡。解淀粉芽孢杆菌FS6对人参真菌病原菌菌丝生长和孢子萌发过程具有明显的抑制作用，而且能够影响人参根际土壤中真菌和细菌的组成，从而对人参灰霉病起到防治效果[13]。此外，解淀粉芽孢杆菌对大豆疫霉菌[14]、香蕉枯萎病菌[15]、串珠镰刀菌[16]都具有抑制作用。在小麦茎基腐病防治方面，解淀粉芽孢杆菌YB-161能够抑制假禾谷镰刀菌的菌丝生长，用菌液拌种后可以有效降低小麦茎基腐病的发生，并且还具有一定的增产效果[17]。

解淀粉芽孢杆菌HB-081 是河南科技学院资源与环境学院植物病理学实验室从女贞叶片中分离获得的1 株内生细菌，前期研究发现该菌株对假禾谷镰刀菌具有较好的拮抗效果[18]。为提升菌株HB-081 的发酵水平，采用单因素试验和正交试验对菌株HB-081 的培养基组成及发酵条件进行优化，同时分析了无菌发酵液的稳定性，从而为该菌株的开发和实际应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 假禾谷镰刀菌、解淀粉芽孢杆菌HB-081，均由河南科技学院资源与环境学院植物病理学实验室分离并保存。

1.1.2 供试培养基 PDA 培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g、水1 000 mL；BPY 培养基：牛肉浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；LB 培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；NA 培养基：牛肉浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL，pH值7.2；NB培养基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖10.0 g、酵母提取物1.0 g、水1 000 mL，pH 值7.2；YT 培养基：蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖1.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株HB-081发酵条件优化

1.2.1.1 种子液制备 挑取菌株HB-081 适量菌体于50 mL 的LB 液体培养基中，28 ℃、180 r/min 培养24 h。

1.2.1.2 最适培养基筛选 将菌株HB-081 种子液1 mL 分别接种到50 mL 的BPY、LB、NA、NB、YT 液体培养基中，28 ℃、180 r/min 培养48 h 后，用紫外分光光度计对不同培养基中发酵液的OD600进行测量。另外，将发酵液于12 000 r/min 离心15 min，再将上清液用0.22µm 微孔滤膜过滤，以获得无菌发酵液。将无菌发酵液按照10%体积比与PDA 培养基混合倒板，之后在平板中心接入直径约5 mm 的假禾谷镰刀菌菌饼。以不加无菌发酵液的PDA 培养基为对照，每个处理重复3 次。28 ℃培养5 d 左右，待对照即将长满培养皿时，计算抑菌率。抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.2.1.3 最适碳源、氮源及无机盐筛选 以最适培养基为基础培养基，分别添加1 g/L的葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖作为碳源，制成不同碳源培养基；最适碳源确定后，分别添加10 g/L 的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物和硝酸钾制成不同氮源培养基；在最适碳源、氮源基础上，分别添加5 g/L的氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾制成不同无机盐培养基。将菌株HB-081 种子液以2%接种量置于不同培养基中，28 ℃、180 r/min 培养48 h后，分别对发酵液的OD600和无菌发酵液的抑菌率进行计算。根据最适碳源、氮源、无机盐的筛选结果，设计三因素三水平正交试验确定不同培养基成分的最佳配比。

1.2.1.4 最适pH 值筛选 以上述筛选出来的最适培养基为基础，调整pH 值分别为4、5、6、7、8、9，按照2%接种量将菌株HB-081 种子液接种至不同pH值培养基中，28 ℃、180 r/min 培养48 h后，对无菌发酵液的抑菌率进行计算。

1.2.1.5 最适温度筛选 按照2%接种量将菌株HB-081 种子液接种至最适pH 值培养基中，分别于24、28、32、36、40 ℃，180 r/min 培养48 h 后，对无菌发酵液的抑菌率进行计算。

1.2.1.6 最适装液量筛选 在上述筛选出来的最适培养条件下，于250 mL 三角瓶中分别盛装50、75、100、125、150 mL 最适培养基，并按照2%接种量接种菌株HB-081 种子液，28 ℃、180 r/min 培养48 h后，对无菌发酵液的抑菌率进行计算。

1.2.1.7 最适接种量筛选 在上述筛选出来的最适培养条件下，分别按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种菌株HB-081种子液，28 ℃、180 r/min培养48 h后，对无菌发酵液的抑菌率进行计算。

1.2.1.8 最适发酵时间筛选 在上述筛选出来的最适培养条件下，分别发酵培养12、24、36、48、60、72 h，对无菌发酵液的抑菌率进行计算。

1.2.2 菌株HB-081无菌发酵液的稳定性分析

1.2.2.1 热稳定性 将菌株HB-081 在最适发酵条件下培养后获得的无菌发酵液分别在40、60、80、100 ℃条件下水浴30 min，冷却至室温后，按照10%体积比与PDA 培养基混合倒板，皿内接入直径约5 mm 的假禾谷镰刀菌菌饼。以未用温度处理的无菌发酵液为对照，以不加无菌发酵液的PDA 培养基为空白对照，每个处理重复3 次。28 ℃培养5 d 后，计算不同温度处理下无菌发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=（空白对照菌落直径-处理菌落直径）/（空白对照菌落直径-未处理菌落直径）×100%。

1.2.2.2 紫外线稳定性 将菌株HB-081 无菌发酵液置于40 W 紫外灯下照射（距离30 cm），照射时间分别为30、60、120、180、240 min。以未用紫外线处理的无菌发酵液为对照，以不加无菌发酵液的PDA培养基为空白对照，对无菌发酵液的相对抑菌率进行计算。

1.2.2.3 酸碱稳定性 将菌株HB-081 无菌发酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分别调整pH 值为3、5、7、9、11，室温静置2 h 后，再将pH 值调为7。以未用酸碱处理的无菌发酵液为对照，以不加无菌发酵液的PDA 培养基为空白对照，对无菌发酵液的相对抑菌率进行计算。

1.2.2.4 蛋白酶稳定性 在菌株HB-081 无菌发酵液中分别加入1 mg/mL 终质量浓度的胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K，37 ℃处理2 h。以未用蛋白酶处理的无菌发酵液为对照，以不加无菌发酵液的PDA培养基为空白对照，对无菌发酵液的相对抑菌率进行计算。

1.2.3 菌株HB-081脂肽类物质合成基因的PCR 检测 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）对菌株HB-081 基因组DNA 进行提取。采用通用引物分别对bacAB、bamC、eriSa、fenB、ituC、sfp基因进行PCR 扩增[19]（表1）。PCR 反应 体 系：2×TaqPCR Mix 12.5 µL，BACD/BAMC/ERISA/FENB/ITUC/SFP-F（10 µmol/L）1.0 µL，BACD/BAMC/ERISA/FENB/ITUC/SFP-R（10 µmol/L）1.0 µL，DNA 模板1.0 µL，ddH2O 9.5 µL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 脂肽类物质合成基因的PCR检测引物Tab.1 PCR primers of lipopeptide antibiotics synthetic genes

1.2.4 菌株HB-081 对小麦茎基腐病的防治效果试验 挑选颗粒饱满的周麦22种子（河南科技学院小麦中心提供），表面消毒后置于湿润滤纸上进行催芽，待种子露白后分别放入1×108cfu/mL 菌株HB-081 的原始发酵液（以LB 培养基培养获得）和优化发酵液中浸种12 h，然后将种子播种于直径15 cm 的塑料盆钵中，每盆播种20 粒。露白后的种子分别用清水和3%苯醚甲环唑悬浮剂浸种12 h 作为空白对照（CK）和药剂对照，每个处理重复3 次，25 ℃、14 L∶10 D 条件下培养。当小麦长到一叶一心时，将直径约5 mm 的生长于PDA 培养基上的新鲜假禾谷镰刀菌菌饼置于小麦幼苗茎基部，每株麦苗接种一块菌饼，表面覆土2 cm 并保湿48 h。14 d后参照潘娅梅等[20]的方法对小麦茎基腐病的发病情况进行调查，并计算病情指数和防治效果。病情指数=Σ（各病情分级×该病级的发病株数）/（分级标准中最高级别数×调查总株数）×100，防治效果=（空白对照组病情指数-处理组病情指数）/空白对照组病情指数×100%。

2 结果与分析

2.1 菌株HB-081的发酵条件优化

2.1.1 最适培养基筛选 在5 种培养基条件下，菌株HB-081 的无菌发酵液都可以抑制假禾谷镰刀菌的菌落生长，其中以YT为培养基时OD600最大，同时无菌发酵液的抑菌率最高，为52.09%；而LB、NA、NB 培养基中菌株生长较慢，并且无菌发酵液的抑菌活性相对较低，都在40.00%以内（图1）。由此说明，菌株HB-081的最适基础培养基为YT培养基。

2.1.2 最适碳源、氮源及无机盐筛选 以葡萄糖、果糖、甘露醇和麦芽糖为碳源时，菌株HB-081 的无菌发酵液具有明显的抑菌活性，其中以麦芽糖为碳源时的抑菌率最高，为60.00%，并且发酵液的OD600也最大；以蔗糖为碳源时，菌株HB-081 的OD600和抑菌率最低，分别为0.33 和1.30%（图2）。因此，选择麦芽糖为发酵培养基的最适碳源。

以蛋白胨和胰蛋白胨为氮源时，菌株HB-081发酵液的OD600相当，都在1.60 左右，但以蛋白胨为氮源时无菌发酵液的抑菌率最高，为64.35%；硝酸钾为氮源时，发酵液的OD600和无菌发酵液的抑菌率最低，分别仅为0.11和12.17%（图3）。因此，选择蛋白胨为发酵培养基的最适氮源。

图3 不同氮源对菌株HB-081生长量及无菌发酵液抑菌活性的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain HB‑081 and inhibition activity of cell‑free fermentation broth

以氯化钾为无机盐时，菌株HB-081 发酵液的OD600和无菌发酵液的抑菌率最高，分别为1.96 和63.36%；氯化钠为无机盐时，无菌发酵液的抑菌率为58.20%，但发酵液的OD600只有1.27；磷酸二氢钾为无机盐时，无菌发酵液的抑菌率最低，仅为21.55%（图4）。所以，选择氯化钾为发酵培养基的最适无机盐。

图4 不同无机盐对菌株HB-081生长量及无菌发酵液抑菌活性的影响Fig.4 Effects of different inorganic salts on the growth of strain HB‑081 and inhibition activity of cell‑free fermentation broth

根据单因素试验所得最佳碳源、氮源及无机盐设计三因素三水平正交试验，由于菌株HB-081 在3种条件下的发酵液OD600都较好，所以正交试验仅以无菌发酵液对假禾谷镰刀菌的抑菌率为指标。结果表明，3种因素影响菌株HB-081无菌发酵液抑菌效果的顺序为A（麦芽糖）>B（蛋白胨）>C（氯化钾），最佳水平组合为A3B2C2，即最佳培养基配方为麦芽糖10.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，氯化钾5.0 g/L（表2）。

表2 菌株HB-081营养条件正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal experiment about medium composition of strain HB‑081

2.1.3 发酵条件筛选 在初始pH 值为6～8 的条件下，菌株HB-081 无菌发酵液的抑菌率都在60.00%左右，且pH 值为6 时的抑菌率最高，为63.59%；在pH 值为4和9的条件下，抑菌率分别只有23.24%和10.97%（图5A）。因此，菌株HB-081 最佳发酵初始pH值为6。

图5 不同发酵条件对菌株HB-081无菌发酵液抑菌活性的影响Fig.5 Effect of different fermentation conditions on the inhibition activity of strain HB‑081 cell‑free fermentation broth

在发酵温度为28～32 ℃的条件下，菌株HB-081无菌发酵液的抑菌率都在60.00%以上，且温度为28 ℃时的抑菌率最高，为63.05%；温度过低和过高都会影响无菌发酵液的抑菌效果，24 ℃时的抑菌率最低，只有41.74%（图5B）。因此，菌株HB-081 最佳发酵温度为28～32 ℃。

在装液量为50～75 mL 条件下，菌株HB-081 无菌发酵液的抑菌率最高，为62.00%；随着装液量的增加，抑菌率下降，装液量为150 mL 时的抑菌率为53.26%（图5C）。因此，菌株HB-081 最佳发酵装液量为50～75 mL。

在接种量为2%～4%的条件下，菌株HB-081 无菌发酵液的抑菌率相对最好，都在62.00%左右；随着接种量的增加，抑菌率下降，接种量为10%时的抑菌率最低，为51.94%（图5D）。因此，菌株HB-081最佳发酵接种量为2%～4%。

在发酵时间为12 h 时，菌株HB-081 无菌发酵液的抑菌率最低，为13.94%；48 h 时的抑菌率明显提高，为61.48%；随着培养时间的延长，抑菌率出现下降，72 h 时的抑菌率下降到45.89%（图5E）。因此，菌株HB-081最佳发酵时间为48 h。

2.2 菌株HB-081无菌发酵液的稳定性

菌株HB-081 无菌发酵液经40～100 ℃分别处理30 min 后，无菌发酵液的抑菌效果几乎不受影响，相对抑菌率都保持在99.00%以上（图6A）。说明无菌发酵液中的活性物质具有较好的热稳定性。

图6 不同条件下菌株HB-081无菌发酵液的稳定性Fig.6 Antifungal stability of strain HB‑081 cell‑free fermentation broth under different conditions

利用紫外线对菌株HB-081 无菌发酵液进行照射，在30～180 min 的时间内，相对抑菌率都可以保持在95.00%以上；紫外线照射240 min后，相对抑菌率下降为77.23%（图6B）。可见，无菌发酵液具有较好的紫外线稳定性。

菌株HB-081 无菌发酵液在pH 值为5～9 的条件下进行处理后，抑菌效果不受影响，相对抑菌率保持在100.00%左右；但是在pH值分别为3和11的条件下，抑菌活性有所下降，相对抑菌率分别为73.38%和83.74%（图6C）。由此说明，抑菌活性物质不耐强酸和强碱，适宜pH值为5～9。

分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K 对菌株HB-081 无菌发酵液进行处理，相对抑菌率未出现明显变化，都可以保持在99.00%以上（图6D）。表明抑菌活性物质对供试蛋白酶不敏感。

2.3 菌株HB-081脂肽类物质合成基因的PCR检测结果

选择6 种脂肽类物质相关基因的引物对菌株HB-081基因组DNA进行PCR扩增，电泳结果表明，成功扩增出bacAB和fenB基因（图7）。由此推测，菌株HB-081 可能存在芽孢杆菌溶素及丰原素B 合成基因，并产生相应的抗菌物质。

图7 菌株HB-081脂肽类物质合成基因的PCR扩增结果Fig.7 PCR amplification results of lipopeptide biosynthesis genes of strain HB‑081

2.4 菌株HB-081对小麦茎基腐病的防治效果

盆栽试验结果显示，对照组小麦茎基腐病的病情指数为21.57，菌株HB-081 原始发酵液对小麦茎基腐病的防治效果为64.31%，优化后发酵液的防病效果上升到69.74%。此外，使用3%苯醚甲环唑悬浮剂拌种，小麦茎基腐病的病情指数为3.88，防治效果为81.97%（表3）。以上结果表明，菌株HB-081对小麦茎基腐病的发生具有一定的防病能力。

表3 菌株HB-081对小麦茎基腐病的防病效果Tab.3 Effect of strain HB‑081 against wheat crown rot

3 结论与讨论

生防菌株发酵培养基和培养条件的优化，与其是否能够应用于生产密切相关[21]。本研究以菌株HB-081 的菌体量和对假禾谷镰刀菌的抑菌效果作为指标，利用培养基组分的单因素试验和正交试验明确了解淀粉芽孢杆菌HB-081 的最适碳源为麦芽糖（10.0 g/L），氮源为蛋白胨（15.0 g/L），无机盐为氯化钾（5.0 g/L）。采用单因素试验对发酵条件进行优化，结果表明，最适发酵初始pH 值为6、温度为28～32 ℃、装液量为50～75 mL、接种量为2%～4%、发酵时间为48 h。通过对培养基组分和发酵条件的优化，提高了菌株HB-081的抑菌效果。

适宜的发酵条件能够促进拮抗菌产生代谢产物，但不同菌株产生抑菌活性的发酵条件各有不同。如解淀粉芽孢杆菌DP03-4 和Xe01 的最适碳源同为葡萄糖，但最适氮源、无机盐、pH值、温度、转速及培养时间都存在差异[21‐22]。本研究中，菌株HB-081 的最适发酵条件与菌株DP03-4 和Xe01 均有所不同。菌株之间发酵条件存在差异的原因可能与菌株自身特征、分离来源以及靶标病原菌选择不同有关。后续还需进一步完善发酵条件，以符合生产实际的需要。

生防菌能否应用于生产与其稳定性有关，例如芽孢杆菌QHZ-3的发酵液经高温、紫外照射以及强酸强碱的处理后，仍然可以保持较好的抑菌效果[23]。解淀粉芽孢杆菌ck-05 的发酵液耐受80 ℃以下的温度，pH 值为6～8 条件下具有较好的抑制效果，并且对紫外线和自然光照射不敏感，对胃蛋白酶等3种蛋白酶不敏感[16]。本研究发现，菌株HB-081 无菌发酵液经100 ℃处理后相对抑菌率可在99.00%左右，在pH 值为5～9 的条件下抑菌活性不受影响，耐受紫外线的照射，对胃蛋白酶等3 种酶的处理不敏感。可见，菌株HB-081 无菌发酵液稳定性较好，具有应用于田间生产的潜力。

芽孢杆菌产生的拮抗物质主要包括抗生素及抗菌蛋白等，其中的脂肽类物质结构多样、性质稳定，对多种植物病原菌都具有较好的生物活性[24]。高振峰等[25]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1 脂肽物质能够有效降低番茄早疫病的发生，并延缓果实软化。对金黄色葡萄球菌具有显著抑菌作用的解淀粉芽孢杆菌SY11 具有fenA等3 种脂肽类物质的功能基因，并且质谱分析结果显示，该菌株产生的主要抑菌物质为Bacillomycin D[26]。解淀粉芽孢杆菌JY-d1 基因组中具有fenB和ituD基因，而且伊枯草菌素粗提物具有较好的抑菌效果[27]。本研究通过PCR 检测发现，菌株HB-081 存在bacAB和fenB基因，后续还应对该菌株产生的脂肽类抗菌物质进行分离与鉴定，为进一步的开发利用提供依据。