pH 值对猪粪与菌糠共发酵产酸特性及微生物群落的影响

任元森，张海波，程红艳，王雨萌，罗 渊，刘 娜

（山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801）

随着经济的迅速发展以及人民生活水平的逐步提高，生猪养殖业规模不断加大，我国2020 年生猪出栏数达4.07 亿头，粪尿年产生量巨大[1]。生猪粪含有大量的病原体，包括总大肠菌群、大肠杆菌和沙门氏菌[2]，处理不当会对环境安全和人体健康造成影响。因此，加快猪粪无害化处理和资源化利用对我国畜牧业可持续发展具有重要意义。针对畜禽粪便面源污染，目前主要有3种处理方式，分别为集中利用、堆肥和厌氧发酵[3]。与前2 种方式相比，厌氧发酵既能生成清洁能源，又可解决猪粪乱堆放造成的环境问题，具有很好的环境效益与经济效益[4]。挥发性脂肪酸（VFA）是厌氧发酵重要的中间产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸。VFA 相比于甲烷具有更高的利用价值和更广泛的应用，例如能够用于废水处理和高附加值生物聚合物合成[5‐6]，还可用于聚羟基链烷酸酯生物合成[7]、微生物燃料电池发电以及合成中链羧酸[8]。因此，利用猪粪厌氧发酵产VFA 是实现猪粪资源化利用的有效途径之一。然而，传统猪粪低碳氮比（C/N）厌氧发酵效率低，限制了其在厌氧消化领域中的应用[9]。猪粪与高C/N 物质共发酵可有效解决上述问题。目前，与猪粪厌氧共发酵的添加物多采用农业废弃物（如秸秆）。菌糠是食用菌栽培后废弃的培养基质，具有较高的C/N，且含有大量的粗纤维、多糖、粗蛋白等物质，是猪粪厌氧共发酵理想的添加物。另外，我国菌糠产量大，据统计，2018年我国的食用菌总产量达4 000 万t，约占世界总产量的80%[10]。每生产1 kg食用菌可产生3.25～5.00 kg菌糠，照此计算，我国每年可产生1.3～2.0 亿t 菌糠。但大部分菌糠都被当作肥料利用或被丢弃、焚烧[11‐12]，较少将其作为厌氧共发酵添加物利用。

厌氧发酵是微生物和酶共同参与的生物学过程，其中pH 值是影响VFA 类型和产量的重要因素[13]。据报道，当初始pH 值为6 时，厌氧发酵餐厨垃圾的水解效率和产酸量最高，产物以乙酸和丁酸为主，约占总VFA 的77%[14]；FENG 等[15]将活性污泥的pH 值从4.0 调至11.0 发现，初始pH 值为8.0 时产酸量最大，VFA 的成分主要为丙酸，其次为乙酸；CHEAH 等[16]利用厌氧消化污泥和餐厨垃圾厌氧共发酵发现，碱性（pH 值9）条件下产酸量高于酸性（pH 值6），pH 值为9时乙酸占总VFA 的91%。基于此，推断pH 值与发酵底物的类型密切相关，即pH值对不同原料的发酵产物积累量、组分与微生物群落结构的影响不一致。然而，到目前为止，未见关于pH 值对猪粪和菌糠厌氧共发酵及微生物群落结构影响的报道。

因此，拟以猪粪和灵芝菌糠为原料进行厌氧发酵试验，探究不同pH 值对猪粪与菌糠共发酵产酸特性以及微生物群落的影响，明确利于猪粪、菌糠厌氧共发酵产VFA 的最适pH 值，阐述不同pH 值调控下微生物群落的变化规律，为猪粪和菌糠的资源化利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试猪粪取自山西农业大学牧站，经简单剔除动物毛发和大块石子等杂物后放入-4 ℃冰箱保存；供试灵芝菌糠取自山西农业大学食用菌中心，自然风干后，使用粉碎机粉碎，过250 µm 筛，备用。发酵原料的基本理化性质见表1。

表1 发酵原料特性参数Tab.1 Characteristic parameters of anaerobic fermentation feedstock

1.2 试验设计

试验设置7 个处理：不调节pH 值（对照，CK）、pH 值为4.0、pH 值为5.5、pH 值为7.0、pH 值为8.5、pH 值 为10.0、pH 值 为11.5，以 下 分 别 简 称CK、pH4.0、pH5.5、pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5，每个处理设置3 个重复。具体操作：首先，将存放于-4 ℃的猪粪搅拌均匀，猪粪与水按质量比1∶1稀释，然后按猪粪与菌糠干质量比（TS猪粪/TS菌糠）5∶1 加入灵芝菌糠，发酵液有效体积控制为400 mL（用去离子水调节），发酵底物TS 控制为10.0%，将其放置于振荡箱中振荡至混匀。然后使用2 mol/L 的盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）溶液分别调节pH 值至4.0、5.5、7.0、8.5、10.0、11.5，其中未调节pH 值组作为对照组（每次取样后重新调节pH 值为4.0、5.5、7.0、8.5、10.0、11.5）。调好pH值之后通入氮气5 min，创造厌氧环境，迅速塞上涂抹凡士林的橡胶塞并用保鲜膜缠绕包裹封口，然后置于37 ℃生化培养箱中培养13 d。分别在第0、1、3、5、7、9、11、13 天时取CK、pH4.0、pH5.5、pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5 处理的发酵液，经3 000 r/min 离心5 min 后，取上清液过0.45µm 滤膜，测定样品的pH 值及可溶性化学需氧量（SCOD）、氨氮、总磷、VFA 质量浓度。选取不同处理的酸积累最大日与最优产酸组处理的不同发酵天数（第0、7、11、13 天）样品，进行细菌群落结构分析。所取微生物分析样品均放入10 mL 离心管，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 理化参数测定

1.3.1 理化指标测定 TS 和VS 采用质量法测定[17‐18]，pH 值采用雷磁pHS-3C 型pH 计测定，SCOD质量浓度采用重铬酸钾法测定，氨氮和总磷质量浓度都使用参数水质测定仪（5B-3B，北京连华永兴科技）测定，C 和N 含量使用有机元素分析仪（Elementar Vario MACRO cube，德国）测定。

1.3.2 VFA测定 VFA质量浓度采用配有FID检测器的TRACE™1300型气相色谱仪测定，色谱柱型号为DB-FFAP（30µm×1.0µm×0.53µm），采用程序升温模式：首先在80 ℃柱温下停留1 min；以20 ℃/min速度升温至110 ℃，停留1 min；再以10 ℃/min 升温至180 ℃，停留1 min。整个过程共耗时11 min，最后根据各VFA 的保留时间对其进行定性，并通过外标法进行定量分析。各VFA 质量浓度均以化学需氧量（COD）计算，其COD转换系数详见表2。

表2 VFA组分COD转换系数Tab.2 COD conversion factors of VFA components

1.3.3 微生物测定 根据E.Z.N.A.®soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行微生物群落总DNA 抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，DNA 浓度和纯度采用NanoDrop 2000测定；采用338F（5′-ACTCCTACGGG‐AGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGG‐TWTCTAAT-3′）引物对16S rRNA基因V3—V4可变区进行PCR 扩增；采用上海美吉生物医药科技有限公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.4 数据处理

使用Excel 2020 处理数据，使用Origin 2020、R语言vegan软件包作图。

2 结果与分析

2.1 猪粪与菌糠厌氧共发酵过程发酵液pH值的变化

由图1可知，pH7.0、pH8.5、pH10.0、pH11.5处理与CK 在发酵初期发酵液中pH 值波动明显，然后逐渐趋于稳定。这是由于发酵初期系统生成VFA 的速率大于生成甲烷的速率，导致VFA 逐渐积累，pH值快速下降。由图1 可知，共发酵11 d 后，pH 值变化趋于稳定。pH4.0、pH5.5 处理，发酵初期pH 值不降反升可能原因有两方面：一方面是由于产酸量较少，积累的酸量未能使发酵系统的pH 值降低；另一方面是发酵液的总碱度对酸化环境具有自我缓冲调控能力。

图1 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵液中pH值的变化Fig.1 Change of pH value in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values regulating

2.2 猪粪与菌糠厌氧共发酵过程发酵液VFA质量浓度的变化

由图2可知，从总体上看，VFA质量浓度随发酵时间推移呈先上升后下降的趋势。这是由于在厌氧发酵初期，易降解有机物迅速分解，厌氧酸化速率远高于产甲烷速率，造成VFA 大量积累。所有处理的酸积累量在第9～11 天时达到最大值，其中pH8.5 处理产生的VFA 最多，为36 736.29 mg/L，较发酵初期质量浓度增加了32 298.61 mg/L，是CK 的1.36倍。pH4.0、pH11.5处理VFA产量较低。

图2 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵液中VFA质量浓度的变化Fig.2 Change of concentration of VFA in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values regulating

2.3 猪粪与菌糠厌氧共发酵过程发酵液VFA组分的变化

由图3 可得，发酵第0 天（图3a）的VFA 各组分占比与各处理酸积累最大日（b）时有很大差别。CK组分占比变化最大，第0天时丁酸（正丁酸、异丁酸）为VFA 主要成分；随发酵进行，在VFA 积累量最大日，丁酸占比由原来的41.36%降低至25.67%，戊酸（异戊酸、正戊酸）占比也由24.27%下降至12.70%，乙酸则成为占比最高的VFA，由20.65%上升至40.82%。pH4.0、pH5.5 处理均是乙酸占比下降，而戊酸占比上升，分别由12.29%、8.60% 上升至19.51%、19.61%。pH7.0、pH8.5、pH10.0 处理均是乙酸占比明显上升，分别由31.68%、30.77%、41.27%上升至41.06%、46.00%、48.70%。pH11.5 处理的VFA 组分变化不明显，这可能与该处理产酸量不高有关系。

图3 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵液中VFA组分的变化Fig.3 Change of VFA components in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values regulating

2.4 猪粪与菌糠厌氧共发酵过程发酵液总磷与氨氮质量浓度的变化

由图4a 可知，CK、pH4.0、pH5.5 处理发酵液中总磷质量浓度较高，且随发酵时间推移总体呈波动上升趋势。pH8.5、pH10.0 处理总磷质量浓度较低，随时间推移波动小。随发酵时间推移，pH11.5 处理总磷质量浓度较pH8.5、pH10.0处理有明显提高。

图4 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵液中总磷（a）和氨氮（b）质量浓度的变化Fig.4 Change of total phosphorus concentration（a）and ammonia nitrogen concentration（b）in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values regulating

氨氮质量浓度随时间推移变化如图4b 所示。发酵液中的氨氮主要来自猪粪和菌糠厌氧消化过程中氨基酸、蛋白质等大分子有机物质的水解。总体来看，在偏酸性的环境中（CK、pH4.0、pH5.5处理）氨氮质量浓度随时间推移逐渐升高，且较碱性条件下氨氮质量浓度高。pH7.0、pH8.5 处理氨氮质量浓度随发酵时间推移呈现先升高后下降的趋势。pH10.0、pH11.5 处理氨氮质量浓度始终维持在较低水平。

2.5 猪粪与菌糠厌氧共发酵过程发酵液SCOD质量浓度的变化

不同pH 值调控下各反应体系的SCOD 质量浓度随发酵时间推移变化如图5所示。随着发酵的进行，SCOD 质量浓度总体呈现先上升后下降的趋势。各处理的SCOD 质量浓度最大值分别为38 827.50 mg/L（CK）、27 842.50 mg/L（pH4.0 处理）、29 422.50 mg/L（pH5.5 处理）、40 595.00 mg/L（pH7.0 处理）、36 832.50 mg/L（pH8.5 处 理）、41 422.50 mg/L（pH10.0 处理）、53 875.00 mg/L（pH11.5 处理），较各自发酵初始（发酵第0 天）SCOD 质量浓度分别增长了 63.16%、33.10%、38.03%、88.97%、64.95%、41.18%、90.79%。

图5 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵液中SCOD质量浓度的变化Fig.5 Change of SCOD concentration in fermentation broth of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values regulating

2.6 猪粪与菌糠厌氧共发酵微生物α多样性分析

在OTU 为97%的相似性水平下，对不同pH 值处理酸积累最大日和不同发酵时期最优产酸组的细菌群落多样性进行分析发现，所有样本均有99%的覆盖率，说明未被检测到的物种较少。由表3 可知，pH值对厌氧发酵细菌的丰富度和多样性影响明显。在所有处理中，CK 的香侬（Shannon）指数最大（3.95），这是因为pH 值调控改变了厌氧发酵细菌的生存环境，影响了其活性，细菌需更多时间适应新环境。pH11.5 处理的Shannon 指数最小（2.78），说明强碱环境会严重抑制厌氧发酵细菌的活性。Chao 指数和ACE 指数与细菌群落的丰富度呈正相关，pH8.5 处理的Chao 指数和ACE 指数最大，分别为838.50 和896.97，表明pH8.5 处理的细菌群落丰富度最高，为最优产酸组。些细菌逐渐失去活性。Chao 指数和ACE 在第11 天达到最大值，此时VFA 的产量也最大，而在第13 天这2 个指数均下降，可能是厌氧发酵后期可供细菌利用的底物浓度较低导致的。

表3 不同pH值处理猪粪与菌糠厌氧共发酵酸积累最大日的细菌群落多样性指数Tab.3 Bacterial community diversity index on the maximum day of acid accumulation in pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation under different pH values

表4 最优产酸组pH8.5处理猪粪与菌糠厌氧共发酵不同发酵时期细菌群落多样性指数Tab.4 Bacterial community diversity index at different periods of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation in the optimal treatment of pH value 8.5

2.7 猪粪与菌糠厌氧共发酵细菌物种组成分析

不同pH 值处理与不同发酵时间对细菌群落的影响较大。如图6a所示，在酸积累最大日细菌门水平上，所有处理Firmicutes（厚壁菌门）相对丰度最高（61.11%～95.94%），为优势菌门。所有处理中，pH8.5 处理的 Firmicutes 相对丰度最低，Bacteroidetes（拟杆菌门）的相对丰度最高。

图6 猪粪与菌糠厌氧共发酵门水平细菌多样性分析Fig.6 Bacterial diversities analysis of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation at the phylum level

图6b为最优产酸组（pH8.5处理）条件下不同发酵时期细菌门水平变化情况。由图6b可知，总体上看，Firmicutes 呈先下降后上升再下降趋势，Bacteroidetes 呈上升趋势，Proteobacteria（变形菌门）呈下降趋势。

图7为微生物属水平的变化。酸积累最大日属水平细菌群落的优势菌群主要为Clostridium_sensu_stricto_1（狭义梭菌属）和Terrisporobacter（锥孢杆菌属）。由图7a 知，各处理酸积累最大日时Clostridium_sensu_stricto_1 为优势菌属，相对丰度为12.31%～48.23%。第二优势菌属Terrisporobacter 的相对丰度在酸性条件下明显高于碱性条件下，说明酸性条件更适合其生长繁殖。

图7 猪粪与菌糠厌氧共发酵属水平细菌多样性分析Fig.7 Bacterial diversities analysis of pig manure and spent mushroom substrate co‑fermentation at the genus level

由图7b 知，第0 天时，pH8.5 处理的优势菌属Clostridium_sensu_stricto_1、Terrisporobacter和Lactobacillus（乳酸菌属）相对丰度分别为13.46%、14.17%、22.48%。随着发酵的进行，Lactobacillus的丰度降低，这表明乳酸被降解利用。第7 天与第0天相比，细菌群落变化较大，Clostridium_sensu_stricto_1 和Terrisporobacter相对丰度下降至10.84%、6.55%，Lactobacillus相对丰度<0.1%，Bacteroides（拟杆菌属）相对丰度上升至13.24%。至第13 天发酵结束，Caldicoprobacter（钙杆菌属）相对丰度上升至15.46%，Clostridium_sensu_stricto_1、Terrisporobacter下降至11.32%、4.73%。

3 结论与讨论

与畜禽粪便面源污染的集中利用、堆肥处理方式相比，厌氧发酵既能生成清洁能源，又可解决猪粪乱堆放造成的环境问题，并具有很好的环境效益与经济效益[4]。因此，在未来的研究工作中，应通过对发酵条件的调控，进一步实现猪粪与菌糠资源的高效利用。

pH 值是判断厌氧发酵产酸的重要指标，pH 值一定程度上能够反映出厌氧发酵的产酸情况。本研究中，在发酵进行到第11 天，pH 值变化趋于相对稳定，这可能由于发酵后期甲烷菌活性增强，发酵体系中部分VFA 被分解利用转化为甲烷，VFA 不易积累，使得发酵液的pH值趋于稳定[19]。

VFA 是厌氧发酵重要的中间产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸，VFA 相比于甲烷具有更高的利用价值和更广泛的应用。本研究中，所有处理产酸量在第9～11天时达到最大值，随后VFA 质量浓度下降，这是因为随着发酵反应的进行，易降解有机物被逐渐消耗，水解与酸化速率下降，积累的VFA 被产甲烷菌利用转化为厌氧发酵的终端产物[20]。其中，pH8.5 处理产生的VFA最多，是CK 的1.36 倍，这与STRAZZERA 等[21]的研究结果相似，其研究表明在pH 值8.9 时嗜热污泥酸化率最高。pH4.0、pH11.5处理VFA 的产量较低，这是由于强酸性或强碱性环境会抑制产酸菌的活性[21]，另外，强碱条件下会向发酵系统引入Na+（钠离子），高质量浓度的Na+会抑制厌氧发酵[22]。

厌氧发酵是微生物和酶共同参与的生物学过程，其中pH 值是影响VFA 组分和产量的重要因素[13]。本研究中，pH4.0、pH5.5 处理均是乙酸占比下降，戊酸占比上升；pH7.0、pH8.5、pH10.0 处理均是乙酸占比明显上升；pH11.5 处理组分变化不明显，这可能与该组产酸量不高有关系。有研究表明，碱性条件下乙酸产量更高，本研究结果与其一致，说明pH 值不仅能够影响VFA 的产量，还能够影响其组分[23]。

总磷质量浓度能够反映出有机物的水解，水解的快慢一定程度上能够反映出厌氧发酵的快慢。酸性条件下总磷质量浓度出现明显上升可能是因为猪粪中一部分非溶解态的磷酸盐在盐酸作用下溶解出来，导致总磷质量浓度上升[24]。而在碱性条件下，释放的化合物易与可溶性磷反应后生成沉淀[24]，从而使溶液中磷质量浓度偏低。pH11.5 处理总磷质量浓度反而高于pH8.5、pH10.0处理，这是由于强碱性条件下部分微生物细胞失去活性，其平衡渗透压遭到破坏，碱性物质进入细胞，导致细胞膜磷酸双分子层溶解，释放出大量的可溶性磷[25]。

氨氮主要来自猪粪和菌糠厌氧消化过程中氨基酸、蛋白质等大分子有机物质的水解。在酸性条件下猪粪中的氨基酸脱氨基的速度较快，容易在环境中积累大量氨氮[24]。pH7.0、pH8.5 处理氨氮质量浓度随发酵进行出现先升高后下降趋势，可能是此时环境更接近产甲烷菌的最适pH 值范围，在厌氧发酵后期系统由产酸转变为产气，且部分氨氮作为产甲烷菌的氮源，促使产甲烷菌大量繁殖，造成发酵液中氨氮质量浓度下降[26]。pH10.0、pH11.5 处理氨氮质量浓度始终维持在较低水平，这可能是由于厌氧发酵液中的氨氮在碱性环境中易生成NH3而挥发。

随着厌氧发酵反应的进行，固体有机物可分解成易溶于水的大分子有机物和小分子VFA，从而使消化液中SCOD 质量浓度增加[27]。pH4.0、pH5.5 处理SCOD 质量浓度低于其他处理，这是因为低pH 值会抑制反应体系中水解微生物的活性。有研究表明，当pH 值低于5.4 时，淀粉分解微生物会失去活性[28‐29]。pH11.5 处 理SCOD 最 大 质 量 浓 度 远 高 于 其他处理，这可能是由于高pH 值条件下胞外聚合物（EPS）中的官能团（羧基、羟基、酰胺基团等）被解离，并进一步出现去质子化现象，EPS之间存在强烈静电排斥作用，导致碳水化合物和蛋白质等从细胞内部释放到发酵液中[30‐32]。在厌氧消化后期，SCOD质量浓度呈下降趋势，这可能是由于SCOD 产出速率小于其进一步被转化消耗的速率[33]。

α 多样性是细菌群落的一个重要属性，能够反映环境中物种的多样性和丰富度[34]，pH8.5 处理的VFA 产量最大，Chao 指数和ACE 指数也最大，分别为838.50 和896.97，表明pH8.5 处理细菌群落丰富度最高。细菌群落丰富度和多样性越高，其代谢发酵底物的效率越高，产生的VFA也越多[35]。

不同pH 值处理与不同发酵时间对细菌群落结构的影响较大。所有处理的Firmicutes 相对丰度最高，为优势菌门，这是因为Firmicutes 中大多数菌种可生成内生孢子以抵御外界的不良环境[36]。另外，Firmicutes中还包含多种厌氧菌，其可将有机物分解产生乙酸[37]，这与本研究得到的结果一致，即所有处理中的VFA 主要为乙酸。pH8.5 处理Bacteroidetes的相对丰度最高，这可能是大分子底物被消耗，小分子酸积累造成的[38]；Bacteroidetes 菌种在厌氧环境中很常见，是最为重要的产酸菌之一[39]，这可能是pH8.5处理产酸量高于其他组的重要原因之一。

最优产酸组（pH8.5 处理）条件下不同发酵时期细菌门水平变化，Firmicutes呈先下降后上升再下降趋势，随着厌氧发酵的进行，大分子有机物被转化成小分子有机物，导致Firmicutes 相对丰度下降，而随着发酵的进行一部分难溶解物质会转化为易分解大分子，因而Firmicutes 相对丰度升高[38]，而Bacteroidetes 表现为升高趋势，说明随厌氧发酵进行，产酸量持续增加。Proteobacteria 持续下降，有利于VFA 的积累，其被认为是VFA 的消耗者，在发酵过程中能够消耗丙酸和丁酸[40]。

酸积累最大日细菌属水平的优势菌群主要为Clostridium_sensu_stricto_1 和Terrisporobacter。各 处理酸积累最大日时Clostridium_sensu_stricto_1 为优势菌属，该属能够水解多糖促进产酸[41]，也能够将二糖转化为以乙酸、乙醇、丁酸等为主的代谢产物[42‐43]。第二优势菌属Terrisporobacter 能够发酵葡萄糖产生乙酸和CO2[44]，该属的相对丰度在酸性条件下明显高于碱性，说明酸性条件更适合该菌属生长繁殖。

pH8.5 处理的厌氧发酵过程中属水平细菌群落变化较大，这是因为在菌群不断驯化和动态更替的过程中，适应厌氧发酵环境的功能菌群逐渐丰富，发酵液的菌群多样性和丰度增加[45]。