樱桃谷鸭IP3R3基因多态性与蛋壳品质的关联分析

廖朝美，李杰章，游敏芳，谭光辉，张依裕

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

蛋壳质量是家禽生产中的一个重要指标，影响家禽生产的经济效益和孵化率[1]。优质的蛋壳是抵御外界物理损伤和病原微生物侵入的重要防线[2]。可见，提高蛋壳质量对于减少蛋壳破损带来的经济损失具有重要意义。钙是家禽蛋壳生物矿化过程中最为关键的矿物元素，占蛋壳质量的38 %左右，直接影响蛋壳品质[3]。1,4,5-三磷酸肌醇受体3型(IP3R3)是一种膜糖蛋白复合物，是细胞内质网膜上的Ca2+释放通道，作为钙离子通道能被肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)激活[4-5]。IP3受体(IP3R)是一个普遍存在的Ca2+通道，能介导Ca2+从细胞内主要的Ca2+储存细胞器内质网中释放[6]。当IP3和Ca2+同时存在时，才可以达到对IP3R的最有效刺激，高浓度的IP3可以激活IP3R，引起Ca2+的释放；同时，被激活的IP3R也可以激活邻近的IP3R，使Ca2+快速释放[7]。IP3R有3种亚型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，分别由基因IP3R1、IP3R2和IP3R3编码，具有很高的序列同源性[8]。相关研究结果表明，IP3R3可在鸡的蛋壳腺中表达，且蛋壳腺中钙的含量增加会促进IP3R3的表达[9-11]。可见，IP3R3基因对蛋壳腺中Ca2+离子具有一定的调控作用。此外，大量研究结果表明，IP3R3基因中特异性单核苷酸多态性(SNP)与多种免疫介导的疾病有关，如1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎病等[12-14]。

樱桃谷鸭原产于英国，由北京鸭和埃利斯伯杂交选育而成，因生长快、肉质佳、产蛋率高、饲料转化率高、抗病力强等优点受到养殖者的青睐[15]。随着现代养殖规模的扩大，因蛋壳质量相关问题导致的蛋损失率达10%～15%[16]。因此，提高蛋壳品质是养禽业亟待解决的问题。近年来，对IP3R3的研究主要集中在调节信号通路上，而缺乏其基因多态性对禽类生产性能影响的相关报道。为此，选取樱桃谷鸭为试验样本，通过直接测序法研究IP3R3基因部分功能区SNP对樱桃谷鸭蛋壳品质的影响，旨在为通过分子标记辅助选择改善鸭蛋品质提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物和蛋壳指标

本试验使用的樱桃谷鸭饲养于贵州大学家禽研究所，选择同日出雏、健康无病、同等管理条件下的128只母樱桃谷鸭，90日龄翅膀静脉采血。在45周龄时，对每只母鸭连续7 d收集鸭蛋，以测定蛋质量、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳质量5个指标，对测量的指标进行关联性分析。

1.2 主要试剂和仪器

血液基因组DNA提取试剂盒(DP304)购自天根生化科技北京有限公司；2×EsTaqMaster Mix试剂、琼脂糖和DL2000 Marker均购自重庆擎科生物科技有限公司。

主要仪器：电泳仪(北京六一仪器厂)，梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)，蛋壳强度测定仪和蛋品质分析仪(北京天翔飞域仪器设备有限公司)，核酸浓度检测仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 引物合成及目的片段扩增

根据GenBank收录的鸭IP3R3基因序列(NC_040072.1)，利用在线软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/index2.cgi)预测该基因的功能结构域。

根据MIR结构域，查找DNA序列位置，利用在线软件Primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)进行引物设计，引物信息见表1。PCR扩增采用20 μL体系：10 μL 2×EsTaqMaster Mix，1 μL DNA模板，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加入7 μL ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性8 min；95 ℃变性50 s,按表1中各引物对应的退火温度退火40 s,72 ℃延伸50 s,35个循环;72 ℃延伸7 min。120 V电压条件下,采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳25 min，凝胶成像仪检测拍照。

1.4 数据分析

对128只樱桃谷鸭IP3R3基因的每个扩增片段纯化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行直接测序，采用Chromas软件进行SNP筛查。参照文献[17-18]的方法，用Excel 2019统计IP3R3各个位点的等位基因频率、多态信息含量(PIC)、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、杂合度(He)和Hardy-Weinberg平衡定律适合性检验结果。利用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)网上在线软件进行单倍型及连锁不平衡分析。参照文献[19-20]的方法，采用SPSS 22.0软件中的一般线性模型(Generalized linear models,GLM)单因素方差分析方法分析SNP基因型、双倍型与蛋壳品质的相关性，所有数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 樱桃谷鸭IP3R3基因 SNP位点筛选

利用设计的2对特异引物对樱桃谷鸭IP3R3基因进行PCR扩增，扩增结果见图1。将IP3R3基因原始序列和引物PCR扩增序列进行比对，比对结果见图2。在IP3R3基因MIR功能结构域共发现2个SNP位点，分别为第6外显子的g.5539186 T>C突变和第8外显子g.5540404 G>A突变，2个SNP位点均产生3种基因型，g.5539186 T>C产生3种基因型TT、TC和CC，g.5540404 G>A产生3种基因型GG、GA和AA。2个SNP位点均未导致编码的氨基酸发生改变，均为同义突变。

图2 樱桃谷鸭IP3R3基因SNP序列比对

2.2 樱桃谷鸭SNP位点的群体遗传分析

对樱桃谷鸭IP3R3基因的测序结果进行分析，结果见表2。从表2可以看出，2个SNP位点在樱桃谷鸭群体中均存在3种基因型，g.5539186 T>C位点的优势基因型TT的频率为0.492，优势等位基因T的频率为0.703，多态信息含量为0.330，属于中度多态突变位点(0.25A位点的优势基因型为GG，频率为0.609，优势等位基因型G的频率为0.785，多态信息含量为0.281，属于中度多态。卡方(χ2)检验结果显示，g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位点产生的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 樱桃谷鸭IP3R3基因SNP的群体遗传信息

2.3 樱桃谷鸭IP3R3基因的单倍型和连锁不平衡分析

利用在线软件SHEsis分析樱桃谷鸭IP3R3基因2个SNP位点的连锁不平衡，结果见表3。由表3可知,g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位点之间D′和r2值分别为1.000和0.116，表明2个位点之间不存在强的连锁不平衡(D′>0.75，r2>0.33)。

表3 樱桃谷鸭IP3R3基因SNP位点的连锁不平衡分析

由表4可见，2个SNP位点联合共产生3种单倍型，优势单倍型H3(TG)的频率为0.488，劣势单倍型H2(TA)的频率为0.215。对3种单倍型进行组合得到5种双倍型，优势双倍型H1H3频率为0.423，劣势双倍型H2H2频率为0.039。

表4 樱桃谷鸭IP3R3基因单倍型频率分析

2.4 樱桃谷鸭IP3R3基因各突变位点与蛋壳品质的关联性分析

利用SPSS 22.0软件分析樱桃谷鸭IP3R3基因的SNP位点与蛋壳品质的相关性，结果见表5。从表5可以看出，g.5539186 T>C位点对蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋质量和蛋壳质量的影响均未达到显著水平(P>0.05)。g.5540404 G>A位点GG和GA基因型个体的蛋壳强度显著高于AA基因型个体(P<0.05)，与其他蛋壳品质之间未达到显著(P>0.05)关联水平。

表5 樱桃谷鸭IP3R3基因SNP与蛋壳品质的关联性分析

2.5 樱桃谷鸭双倍型与蛋壳品质的关联性分析

对发现的5种双倍型与樱桃谷鸭蛋壳品质指标进行关联性分析，结果见表6。由表6可知，双倍型H1H1、H1H3、H2H3和H3H3个体的蛋壳厚度和蛋壳强度显著高于H2H2个体的蛋壳厚度和蛋壳强度(P<0.05)，其他蛋壳品质不存在显著差异(P>0.05)。

表6 樱桃谷鸭IP3R3基因SNP位点双倍型与蛋壳品质的关联分析

3 结论与讨论

IP3R3在细胞的内质网(Endoplasmic reticulum,ER)中广泛分布，能与三磷酸肌醇结合形成Ca2+通道而调控细胞内Ca2+浓度[21-22]。IP3R3通道涉及将促凋亡的Ca2+信号转移到线粒体，IP3R3功能或表达的变化与肿瘤的发生和细胞死亡抵抗有关[23]。谭光辉等[24]研究发现,IP3R3基因在鸭的蛋壳腺部呈现高表达，且IP3R3基因可能在蛋壳腺内通过调控Ca2+的释放影响蛋壳的形成。禽类子宫内分泌钙离子是引起蛋壳质量变异的关键因素，钙离子受子宫内多种基因的调控。因此，研究蛋壳矿化时期影响碳酸钙沉积的关键候选基因及其遗传变异对改善蛋壳品质具有重要的意义。IP3R3基因群体遗传特征分析显示，g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位点多态信息含量均处于中度多态，揭示这2个SNP位点有较稳定的遗传力和育种选择潜力[25]；卡方检验结果显示，g.5539186 T>C位点和g.5540404 G>A位点均表现为Hardy-Weinberg平衡状态，可能是因为长期的人工选育使樱桃谷鸭群体处在一个平衡状态[26]。2个SNP位点均为同义突变，说明IP3R3基因在遗传进化过程中有高度的保守性[27]。2个SNP位点的连锁不平衡分析结果显示，g.5539186 T>C位点和g.5540404 G>A位点间不存在强连锁不平衡，说明该群体趋向于独立遗传[28]。

本研究中，g.5539186 T>C位点对蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋质量和蛋壳质量的影响均未达到显著水平，g.5540404 G>A位点GG和GA基因型个体的蛋壳强度显著高于AA基因型个体，与其他蛋壳品质之间未达到显著关联。蛋壳强度能保证蛋内容物的完整性和安全性，是评价蛋壳品质的最有力指标，蛋壳强度增大，会使蛋的破损率大大减少[29]。推测这可能与IP3R3基因调控蛋壳腺内钙含量，从而影响蛋壳的钙沉积有关。REN等[30]研究发现，基因的某单个突变位点可能受到其他多个突变位点的影响。AKEY等[31]在遗传性疾病和性状分析研究中发现，单倍型共同的作用可能比单个SNP位点的作用对性状的影响更大。可见，在品种选育过程中不能只看单个突变位点。本研究中，通过对3种单倍型进行组合，共发现5种双倍型。理论上应有6种双倍型，另外1种双倍型没有检测到，可能是因为在自然选择或人工选育过程中被淘汰，或是由于本研究的样本量太少，没有检测到。将5种双倍型与樱桃谷鸭蛋壳品质指标进行关联性分析发现，双倍型H1H1、H1H3、H2H3和H3H3个体的蛋壳厚度和蛋壳强度显著高于H2H2个体的蛋壳厚度和蛋壳强度。说明2个SNP位点联合引起基因结构变化强于单个SNP对基因结构变化的影响。因此，可以筛选g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位点作为鸭蛋蛋壳品质选择的遗传标记位点。此外，还可以从蛋白质组和转录组等水平进一步深入挖掘，提供更有育种价值的SNP位点或单倍型，以利于家禽育种。

综上，g.5540404 G>A位点对蛋壳强度有显著影响，2个SNP位点组合基因型对蛋壳厚度和强度也产生显著影响，可以筛选g.5539186 T>C和g.5540404 G>A位点作为樱桃谷鸭鸭蛋蛋壳品质选择的遗传标记位点。