耐盐促生菌与其复合菌剂对盐胁迫狼尾草生长及生理生化的影响

时间：2024-05-25

潘宇, 张昊, 李湘, 曹铭芮, 徐兴潮, 宋天顺, 谢婧婧

(南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816)

0 引言

【研究意义】土壤盐渍化是世界性环境难题,我国的盐渍化土地主要分布在东北、西北、华北和沿海地区,总面积超过1亿hm2,占农用耕地的10%,甚至在不断扩大[1]。目前,国内外治理和修复盐渍化土地的主要措施有物理、化学和生物措施,其中,生物措施是较为有效且环境友好的措施。狼尾草须根系发达密集,茎直立粗壮,再生性优良,生物量大,产量高,可在盐渍地种植,具有抗逆性强、环境适应性广和营养价值高等特点,作为优质草资源被广泛应用于观赏和畜牧业等领域。耐盐促生菌是既有耐盐能力又有促生能力(解磷、固氮和产植物激素等)的一类微生物。在耕地逐年减少的背景下,土壤盐渍化问题是制约我国农业发展的重要因素,耐盐促生菌已成为盐渍土壤开发研究的热点。探究高效植物根际促生细菌(PGPR)构建复合菌群用于开发利用盐渍化土壤对保障我国农业可持续发展具有重大战略意义。【前人研究进展】目前,研究较多的耐盐促生菌是假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)。芽孢杆菌作为一种重要的促生菌,具有菌体繁殖系数高、效果好、制剂货架期长和抗逆性强等特点,是优良的微生物肥料菌种之一[2]。逄焕成等[3]研究表明,施用功能微生物菌剂,可提高盐碱土壤中钾细菌和枯草芽孢杆菌的数量,以及土壤有机质和速效NPK的含量。李凤霞等[4]研究表明,施生物有机肥可降低盐碱地的全盐含量并抑制土壤碱化度,提高土壤肥力和改善土壤的微生物环境。马茜等[5]研究发现,微生物菌剂和有机肥配施可显著改善盐渍化土壤性质,提高作物产量。徐伟慧等[6]报道,接种芽孢杆菌单菌剂和复合菌剂均能促进水稻生长发育,具有良好的生长效应。杨晓云等[7]研究表明,接种解淀粉芽孢杆菌B1619对番茄生长有显著的促生效应。【研究切入点】目前,已有研究的促生菌主要从植物根系筛选获得,而对高盐、高碱和高温等特殊环境植物根际促生菌的开发利用较少,且主要针对某种芽孢杆菌对单一作物的促生效应,鲜见关于不同芽孢杆菌以及复合菌剂对同一作物促生效果的研究报道。选择新疆盐渍湖土壤筛选的耐盐促生菌及其与实验室前期筛选的解磷菌贝莱斯芽孢杆菌X-P18和固氮菌枯草芽孢杆菌X-N1制备复合菌剂,探究耐盐促生菌菌株的耐盐促生性,并采用水培法和盆栽试验验证复合菌剂对狼尾草种子萌发及生长的影响。【拟解决的关键问题】探明耐盐促生菌的耐盐性与促生性能,以及复合菌剂对狼尾草种子萌发及生长的影响,以期为盐碱地复合菌微生物肥料的开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样筛菌土壤,采自新疆东台吉乃尔盐渍湖;盆栽试验盐渍土壤,采自江苏盐城。

1.1.2 种子狼尾草种子,由江苏农业科学院提供。

1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨10.0 g,牛肉浸膏 3.0 g,氯化钠 50 g,pH 7.0～7.2。LB培养基:蛋白胨 10.0 g,酵母浸粉 5.0 g,氯化钠 10 g,pH 7.0～7.2。MKB培养基:酪蛋白氨基酸 5.0 g,磷酸氢二钾三水合物2.5 g,硫酸镁2.5 g,甘油15 mL,pH 7.0。

1.1.4 主要试剂 Salkowski显色剂、Taq酶、DNA Ladder Mix、dNTP和ddH2O等,购自南京擎科生物公司;其他试剂均为分析纯,购自国药集团有限公司。

1.1.5 试剂盒 TaKaRa细菌基因组提取试剂盒,购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 耐盐菌株的筛选从新疆盐渍湖土壤样品中称取1 g新鲜土壤加入50 mL离心管,再加入无菌水9 mL,37 ℃、180 r/min的摇床中培养30 min,制成悬浮液。取100 μL置于10 mL的种子培养基中,于37 ℃、180 r/min的摇床中培养24 h。将培养液稀释103、104、105和106倍后,取各梯度培养液100 μL,于含50 g/L NaCl的牛肉浸膏蛋白胨固体培养平板上涂布,将平板放入37 ℃恒温培养箱中培养72 h,挑取不同类型的典型单菌落,并保存菌株。

1.2.2 耐盐碱性能评价耐盐菌株接种于含60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L和100 g/L NaCl的LB液体培养基中,于37 ℃、180 r/min的摇床中培养24 h后,测定OD600;耐盐菌株接种于pH为7、8、9、10和11的LB液体培养基中,于37 ℃、180 r/min的摇床中培养24 h后,测定OD600。

1.2.3 耐盐菌株的促生特性菌株的1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate,ACC)脱氨酶活性,参照文献[8]的方法测定;吲哚乙酸(IAA)产量,采用经典Salkowski法[9]测定;菌株解磷量,采用钼锑抗比色法[10]测定;胞外多糖,采用硫酸-苯酚法[11]测定;嗜铁素活性采用紫外吸收法测定[12]。

1.2.4 菌株鉴定

1) 形态学鉴定。将筛选得到的菌株在LB固体培养基上37 ℃培养 24 h,观察其形态,并参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]和《伯杰细菌鉴定手册》[14]对菌株进行生理生化鉴定。

2) 分子生物学鉴定。采用试剂盒提取菌株的总DNA,以此为模板,以16S rRNA基因引物对27F/1492R(27F:5′-AGAGT T

TGATCMTGGCTCAG-3′, 1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行纯化扩增,将PCR扩增产物送至南京擎科生物公司进行16S rDNA测序。将测序所得基因序列提交Gen Bank数据库,用BLAST进行序列对比分析,选取同源性高的相关序列采用MEGA 7.0比对分析,并用邻近法构建进化树。

1.2.5 复合菌剂的制备将筛选得到的耐盐菌株枯草芽孢杆菌X-NY1、解淀粉芽孢杆菌X-NY5,与实验室筛选得到的固氮菌枯草芽孢杆菌X-N1及解磷菌贝莱斯芽孢杆菌X-P18分别接种至 LB液体培养基中,37 ℃、180 r/min培养 24 h。将培养好的种子液控制OD600=1.0,然后按总接种量为2%将各菌等比例混合接种于 LB 液体培养基中, 37 ℃、180 r/min培养24 h,然后8 000 r/min离心 10 min后收集菌体沉淀,重悬,调节OD600=1.0,得到各单菌剂及复合菌剂菌悬液(表1)。

表1 不同单菌剂及复合菌剂的成分组成

1.2.6 复合菌剂对狼尾草种子萌发的影响将滤纸(9 cm)灭菌后平铺在培养皿(9 cm)底层,冷却待用;将种子培养液接种至100 mL/250 mL锥形瓶中180 r/min、37 ℃培养24 h,然后8 000 r/min离心10 min,用无菌水0‰(0 g/L)及灭菌的含4‰(4 g/L)、6‰(6 g/L)的氯化钠溶液分别重悬,得到菌悬液,调节OD600=1.0。取适量种子放入100 mL烧杯中,用1.0%(活性氯)的次氯酸钠溶液进行种子表面消毒(以没过种子为准),然后用无菌水清洗3次。采用水培法,以无菌水作空白对照(CK),灭菌的氯化钠溶液为试验组对照(CK1),将配置好的不同处理(A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2、E2、F2、A3、B3、C3、D3和A4)菌悬液加入到玻璃培养皿中,滤纸吸水饱和为止(约15 mL),3次重复,每个培养皿放20粒种子,待种子萌发后,每天同一时间记录发芽状况,以胚芽突破种皮为标准,3 d后完成发芽,测定发芽率(GR)和发芽指数(GI),选取对狼尾草种子萌发耐盐促生效果较好的复合菌剂与各单菌进行后续盆栽试验。

GR=n/N×100%

GI=∑Gt/Dt

式中,n为发芽终期全部正常发芽的种子数,N为供试种子数,Gt为处理后t日的发芽数,Dt为相应的发芽日数。

1.2.7 盆栽试验试验于 2022年5-6月在温室中采用盆栽形式进行,每盆装盐渍土壤450 g(pH 8.30,盐度4 ‰,有机质含量为15.64 g/kg,碱解氮含量为32.20 mg/kg,速效磷含量为23.84 mg/kg)。共设 9个处理,分别为CK、A1、B1、C1、D1、E2、B3、C3、D3,3次重复。其中,CK为空白对照,不施任何菌剂;其他处理组均按6.67%(质量比)添加微生物菌剂后混匀,待狼尾草全部发芽后第3天(即播种后第7天),各处理再施微生物菌剂1次。每盆种植狼尾草种子20粒,放置在 12 h光照/12 h 黑暗条件下(光照强度4 000 lx)、(25±2) ℃温室中培养,萌发前每天浇灌等量清水,萌发后隔 3 d浇水1次,种植30 d后测定植株的农艺性状和生理特性。

1) 农艺性状调查。株高,生长周期结束后(30 d)随机选取植株,测定从根基部到最高生长点的距离(cm),15次重复。地上生物量,盆栽结束后,将地上部分与根分离,称取地上部分全部新鲜植株的重量,放入-20 ℃冰箱保存备用。

2) 生理特性测定。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[15]测定,可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法[16]测定;游离脯氨酸采用酸性茚三酮法[17]测定;叶绿素相对含量(SPAD值)采用手持叶绿素仪测定[18]。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

2.1.1 耐盐菌株的筛选与纯化从含有5%氯化钠的牛肉浸膏蛋白胨培养基中分离纯化得到2株耐盐菌,分别命名为X-NY1和X-NY5。从图1看出,X-NY5在NaCl浓度为 100 g/L和pH 11.0条件下仍可生长,X-NY1在NaCl浓度为80 g/L和pH 10.0条件下也能继续生长,表明2株耐盐菌均有良好的耐盐碱性能。因此,对其进行下一步试验。

图1 X-NY1和X-NY5菌株的耐盐能力(A)和耐碱能力(B)

2.1.2 X-NY1和X-NY5菌株的形态及生理生化特性从图2看出,X-NY1菌株为杆状,菌落微黄色表面粗糙不透明,中央隆起有褶皱。X-NY5菌株为杆状,菌落淡黄色表面粗糙不透明,有隆起,边缘不规则。从表2可知,2株耐盐菌的生理生化特征表现一致,X-NY1和X-NY5菌株除与甲基红呈阴性反应外,与其余项目均呈阳性反应。

图2 X-NY1、X-NY5的革兰氏染色(A、C)和菌落形态(B、D)

2.1.3 X-NY1和X-NY5菌株的分子生物学鉴定将X-NY1和X-NY5菌株测序所得16S rDNA序列提交Gen Bank数据库,采用BLAST进行序列对比分析,X-NY1菌株与Bacillussubtilis的同源性达99%,X-NY5菌株与Bacillusamyloliquefaciens的同源性也达99%(图3),结合生理生化特征,X-NY1和X-NY5菌株分别为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

图3 X-NY1和X-NY5菌株的系统发育树

2.2 耐盐菌株X-NY1和X-NY5的促生特性

耐盐促生菌的促生特性一般通过直接和间接的方式促进植物生长,直接作用指菌株通过合成和分泌植物激素、生物固氮和溶磷等促进植物生长;间接作用指菌株通过诱导植物产生拮抗物质等方式降低病原微生物的有害作用,抑制植物病害,促进植物生长。从表3可知,X-NY1和X-NY5均可产吲哚乙酸、胞外多糖、溶磷、嗜铁素和ACC脱氨酶等,其产能分别为16.72 mg/L和15.26 mg/L、90.86 mg/L和136.30 mg/L、20.38 mg/L和21.94mg/L、0.53和0.47、1.20 U/mg和1.66 U/mg,表明其均具有较好的促生作用。

表3 耐盐菌株X-NY1和X-NY5的促生特性

2.3 盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草种子的发芽率和发芽指数

从图4看出,无菌水空白对照(CK)的发芽率和发芽指数分别为98.33%和33.22。0‰盐浓度胁迫下,不同成分菌剂处理(A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2、E2、F2、A3、B3、C3、D3和A4)的发芽率和发芽指数分别为58.33%～91.67%和17.50～30.67,其中,B3、C3和D3抑制程度较低,发芽率和发芽指数分别为90.00%/28.67、90.00%/30.67和91.67%/28.28。4‰盐浓度胁迫下,灭菌氯化钠溶液对照(CK1)的发芽率和发芽指数分别为78.33%和20.89;不同成分菌剂处理的发芽率和发芽指数分别为68.33%～88.33%和17.06～25.56,其中,B3、C3和D3对种子的萌发效果较好,其发芽率和发芽指数分别为88.33%/24.39、88.33%/24.06和86.67%/24.28。6‰盐浓度胁迫下,CK1的发芽率和发芽指数分别为83.33%和21.28;不同成分菌剂处理的发芽率和发芽指数分别为62.50%～91.67%和19.89～25.78,其中,B3、C3、D3和E2对种子的萌发效果较好,其发芽率和发芽指数分别为85.00%/23.83、85.00%/24.28、91.67%/25.78和88.33%/25.72。可见,复合菌剂B3、C3、D3和E2对狼尾草种子有较好的耐盐促生作用。因此,选择对狼尾草种子耐盐促生作用效果较好的复合菌剂(B3、C3、D3、E2)及各单菌剂进行后续盆栽试验。

图4 盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草种子的发芽率和发芽指数

2.4 盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草的生长及生理特性

2.4.1 狼尾草的地上生物量和株高从图5可知,盐胁迫下,不同处理狼尾草的地上生物量和株高分别为1.19～2.69 g/5株和18.41～26.17 cm,均以D3最高,CK最低。D3地上生物量较CK提高127.08%,较单菌剂A1、B1、C1和D1分别提高27.82%、82.88%、44.06%和11.67%;D3株高较CK提高42.15%,较单菌剂A1、B1、C1和D1分别提高21.98%、41.50%、21.59%和26.60%。表明,接种D3复合菌剂对狼尾草的促生效果最好,能够改善狼尾草在盐渍土的生长状况,缓解盐胁迫对狼尾草生长造成的抑制作用,提高狼尾草对盐胁迫的抵抗能力。

图5 盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草的地上生物量和株高

2.4.2 生理生化特性从图6看出,盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白含量及叶绿素含量(SPAD值)变化。丙二醛含量:不同处理为1.86～7.46 mmol/g,依次为CK>C1>B1>D3>C3>E2>A1>D1>B3;不同菌剂处理C1最高,仅较CK降低0.58%;B3最低,较CK降低75.07%,表明添加微生物菌剂可降低盐胁迫对狼尾草受的伤害。脯氨酸含量:不同处理为65.93～709.80 μg/g,依次为D3>C1>A1>C3>B3>D1>E2>CK>B1;不同菌剂处理D3最高,较CK提高373.35%;B1最低,较CK降低56.03%。可溶性蛋白含量:不同处理为0.26～5.12 mg/g,依次为D3>B3>A1>E2>C1>C3>D1>B1>CK,不同菌剂处理D3最高,较CK提高1 892.02%。SPAD值:不同处理为10.13～17.74,依次为D3>C3>B3>B1>D1>E2>A1>C1>CK,不同菌剂处理D3最高,较CK提高75.18%。

图6 盐胁迫下不同成分菌剂处理狼尾草的生理生化特性

3 讨论

耐盐促生菌一般通过直接和间接的方式促进植物生长[19],直接作用指菌株通过合成和分泌植物激素、生物固氮、溶磷等促进植物生长;间接作用指菌株通过诱导植物产生拮抗物质等方式降低病原微生物的有害作用,抑制植物病害,进而促进植物生长。李福艳等[20]筛选出3株高效产IAA的菌株(YC9L、YC3172和YC5064),产力为46.72～67.55 mg/L,其中,YC9L和YC5064对玉米种子发芽及幼苗生长具有促进作用。SHARMA等[21]从耐盐植物根系土壤筛选出具有产IAA的促生菌,产力为11.5～19.1 mg/L,且促生菌成功地定殖在花生根际,并在非胁迫和胁迫条件下均能促进其生长;朱梦卓等[22]筛选出具有较好促生、耐盐和抗旱能力的野大豆内生细菌菌株YDX26,其具有多重促生能力,其中,产ACC脱氨酶能力高达3.95 U/mg、IAA活性为19.97 mg/L,对水稻幼苗株高、根长、地上部干重与地下部干重均有明显促进作用;李华山等[23]筛选出1株具有较高ACC脱氨酶活性(4.05 U/mg)的耐盐促生菌,能够在盐胁迫条件下显著促进黄瓜幼苗的生长发育。MDA含量降低往往与脯氨酸含量的升高有关,脯氨酸可以提高植物的抗寒性,稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库在调节细胞氧化还原等方面起重要作用[24-26]。可溶性蛋白是植株抗逆性的重要指标之一,也是植物体内重要的渗透调节物质和营养物质[27]。张宜辉等[28]研究表明,在200 mmol/L NaCl盐胁迫下,外源添加浓度为1×108cfu/L的BM1259可促进构树根长、株高和叶面积的增加,叶绿素含量提高,光合效率增强,可溶性糖和可溶性蛋白的含量显著提高,丙二醛含量降低,幼苗SOD、POD和CAT抗氧化酶的活性提高,进而有效缓解盐胁迫对构树幼苗造成的伤害。廉华等[29]报道,施入103cfu/g、104cfu/g、105cfu/g、106cfu/g和107cfu/g棘孢木霉菌剂均能有效提高黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶面积、全株鲜重、全株干重、根冠比和壮苗指数,其中,106cfu/g棘孢木霉菌剂处理对黄瓜幼苗叶片叶绿素含量、根系活力、硝态氮含量、硝酸还原酶活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量的促进效果最好。盐胁迫会抑制植株体的光合色素如叶绿素的合成,进而影响光合作用效率,间接地影响狼尾草植株的生长发育[30-31]。JI等[32-34]研究表明,盐胁迫条件下接种芽孢杆菌能够促进植物生长,并有效缓解盐分对植物的生长抑制,提高植物的耐盐性能;芽孢杆菌属菌株对不同胁迫均具有耐受性及促生特性,其定殖在植物根部可促进生长,提高植物株高、生物量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和叶绿素含量,降低丙二醛含量。

研究结果表明,分离纯化得到2株耐盐碱菌X-NY1和X-NY5,经形态、生理生化及分子鉴定,X-NY1和X-NY5菌株分别为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens);X-NY1和X-NY5可产吲哚乙酸、胞外多糖、溶磷、嗜铁素和ACC脱氨酶等,产能分别为16.72 mg/L和15.26 mg/L、90.86 mg/L和136.30 mg/L、20.38 mg/L和21.94 mg/L、0.53和0.47、1.20 U/mg和1.66 U/mg;复合菌剂X-NY1+X-NY5+X-P18、X-NY1+X-N1+X-P18、X-NY5+X-N1+X-P18和X-NY5+X-P18对狼尾草种子有较好的耐盐促生作用,以X-NY5+X-N1+X-P18的耐盐促生效果最好,狼尾草的地上生物量和株高较CK分别提高42.15%和127.08%,丙二醛含量较CK降低75.07%,脯氨酸、可溶性蛋白含量和SPAD值分别较CK提高373.35%、1 892.02%和75.18%。可溶性蛋白的含量与张宜辉等[28-29]的研究结果一致,MDA含量与王鲁等[35]的研究结果一致。植物在受到盐胁迫时,植株体内的蛋白质合成受阻,而接种耐盐促生效果好的复合菌剂可能参与了植物渗透调节,其可溶性蛋白继续积累,维持狼尾草正常生理代谢活动。MDA是植物细胞膜受损的重要指标,盐胁迫导致植物膜脂过氧化产物 MDA含量积累,添加耐盐促生效果好的复合菌剂狼尾草MDA含量较未接种(CK)显著降低,表明其可作为抗氧化剂参与活性氧的清除,从而缓解狼尾草因盐胁迫造成的氧化损伤。脯氨酸在一定程度上可维持细胞渗透压,提高细胞持水能力,减轻胁迫对狼尾草带来的损伤,盐胁迫可以诱导植物脯氨酸的积累,而添加耐盐促生效果好的复合菌剂可诱导狼尾草积累更多的脯氨酸提高其渗透调节能力,增强狼尾草对盐胁迫的抵抗力[36]。总叶绿素含量的高低可体现植物光合作用的强弱[37],盐胁迫可使狼尾草叶绿素降解,耐盐促生效果好的复合菌剂可作为保护物质避免狼尾草受到伤害,从而提高叶绿素含量,达到减轻盐胁迫的作用。