EMS诱变对不同萌发状态草莓种子发芽率的影响

宋兰芳, 华明艳, 崔少杰, 金凤媚, 孔维东, 孙海波

(天津市农业科学院 现代都市农业研究所, 天津 301700)

0 引言

【研究意义】育种中常用的化学诱变剂主要有烷化剂(如甲基磺酸乙酯、甲基硫酸甲酯)碱基类似物、叠氮化钠及抗生素[1]。甲基磺酸乙酯(EMS)诱变谱非常广,能产生断裂突变、错义突变等[2],而且EMS在多倍体植物中产生的点突变频率很高[3],是一个高效的诱变剂,对植株损伤较小,产生的突变性状丰富,而且多为显性突变体,便于突变体的筛选,可以针对植物某一性状进行有效改良。草莓的高杂合性和多倍性等特点,导致其新品种培育存在培育周期长、效率低、工作量大等问题[4],因而需要研究效率更高的育种手段,为草莓新品种的选育提供丰富的种质资源和遗传背景。【前人研究进展】EMS已在水稻[5]、小麦[6]、玉米[7]等多种作物中用于新种质的创造及突变体库的构建[8-9],目前我国关于EMS在草莓上的诱变研究相对较少。草莓诱变育种是获得新种质资源和选育新品种的有效途径之一,其与杂交育种和生物技术结合,更能提高育种效率和水平[10]。刘艳萌等[11]以草莓继代苗为材料,经过EMS处理后培养诱导出再生植株,然后以0.8% NaCl为选择压力进行初步筛选后,发现再生植株对盐渍环境表现出一定的抗性。罗静等[12]使用EMS对草莓品种“幸香”叶片诱导出愈伤组织进行处理后,将愈伤组织接种在含有不同浓度灰霉病毒粗提液的培养基上,发现其对灰霉病抗性突变发生不表现规律性。张经纬[13]采用浓度为0.8%EMS处理草莓品种“丰香”种子48 h,筛选得到一批表型发生显著变化的单株,变异率约为1%,变异大多发生于叶片和果实。【研究切入点】EMS诱变在草莓中的研究材料主要是不同部位的离体材料或愈伤组织,以草莓种子为试材的EMS诱变报道较少。【拟解决的关键问题】通过研究EMS诱变对草莓不同种子萌发率的影响,旨在观察EMS对草莓种子的诱变反应,确定EMS对草莓种子诱变的最佳条件,为后期八倍体草莓突变体库的构建奠定基础,为进一步发展草莓的EMS诱变育种提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为天津市农业科学院选育的八倍体草莓品种“津韵1号”自然授粉种子。

1.2 试验设计

试验在天津市农业科学院创新基地进行。以4种不同萌发状态的草莓种子即风干种子(自然晾干种子)、吸胀种子(种子浸泡36 h)、萌动种子(种皮吸胀微开裂未露芽种子)和萌发种子(冒白尖的种子)为试验材料,设置5个EMS浓度处理梯度(0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),每个浓度设置3个处理时间(8 h、12 h、16 h),共60个处理,其中以0% EMS为对照(CK),每处理100粒种子,3次重复。

挑选不同萌发状态的种子,用纱布包好,放入装有不同浓度EMS的蓝盖试剂瓶中进行诱变处理,期间置于温度25 ℃、转速80 r/min的摇床上,分别处理8 h、12 h、16 h后,将种子取出,用流水冲洗12 h,以去除种子表面残留试剂。将诱变处理后的种子置于铺有滤纸的培养皿中进行发芽,随后置于恒温培养箱中25 ℃培养,培养1周后进行指标调查。

1.3 调查指标与方法

以CK为参照,在培养过程中,每天进行补水,同时观察种子发芽情况,准确记录种子的起始发芽时间和每日种子发芽数,在培养20 d后,统计种子最终发芽数,并计算草莓种子的发芽率,确定半致死剂量。

发芽率=种子发芽数/种子总数×100%

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2000对测定数据进行统计,用SPSS19.0以Ducan新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 EMS处理草莓风干种子的发芽率

由表1可知,在相同时间下,CK草莓风干种子的发芽率均最高,除处理8 h的CK与EMS浓度为0.4%处理间差异不显著外,均显著高于其他处理。风干种子的发芽率随EMS处理浓度升高而下降,说明EMS对风干草莓种子的萌发有抑制作用。在相同浓度下,EMS浓度为0%～0.4%时,风干种子的发芽率随处理时间延长而升高;EMS浓度为0.6%～1.0%时,风干种子的发芽率随处理时间延长先升高后降低。说明,在低浓度时EMS诱变时间抑制效应在一定程度上大于诱变浓度,可能因为风干种子种皮吸水性较差,对水分和药剂吸收较少,因此进行诱变试验不建议选用风干种子进行处理。

表1 EMS不同浓度和处理时间草莓风干种子的发芽率

2.2 EMS处理草莓吸胀种子的发芽率

由表2可知,草莓吸胀种子的发芽率均高于风干种子,说明草莓种子吸足水分有助于萌发。在相同时间下,吸胀种子的发芽率随EMS处理浓度升高而降低,这与风干种子一致。在相同浓度下,EMS浓度为0～0.4%时,吸胀种子发芽率随处理时间延长先升高后降低;EMS浓度为0.6%～1.0%时,吸胀种子的发芽率随处理时间延长而下降。CK吸胀种子在12 h发芽率最高,16 h次之,8 h最低,说明草莓种子萌发吸足水分所需时间在44～52 h;吸胀种子处理之前种子内部代谢已经活化,诱变剂吸收相对更容易,所以EMS相同浓度下,16 h的发芽率低于12 h。

2.3 EMS处理草莓萌动种子的发芽率

由表3可知,在相同时间下,随着EMS处理浓度增加,草莓萌动种子的发芽率总体呈显著下降趋势,以处理16 h的发芽率下降幅度最大。在相同浓度下,草莓萌动种子的发芽率均随处理时间增加而下降;EMS浓度在0～0.6%时,处理8 h与处理12 h间的萌动种子发芽率差异不大,但均明显高于处理16 h,说明草莓种子在吸足水分后,不能长时间浸泡;EMS浓度在0.8%～1.0%时,草莓萌动种子的发芽率随处理时间延长显著下降,其中,EMS浓度为0.8%处理12 h时,草莓种子的发芽率为52.00%。EMS浓度为0.8%处理12 h时和EMS浓度为0.6%处理16 h时的致死率均接近半致死剂量,可作为EMS诱变条件之一,因为萌动种子长时间浸泡会抑制发芽,所以推荐EMS浓度为0.8%,处理12 h作为萌动种子的最佳诱变条件。综上表明,低浓度EMS处理对草莓种子的发芽率毒害作用较小,随作用时间延长毒害作用显著;高浓度EMS处理对草莓萌动种子的发芽率毒害作用较大,即使时间较短,发芽率也显著降低。

2.4 EMS处理草莓萌发种子的发芽率

由表4可知,在相同时间下,随着EMS处理浓度升高,草莓萌发种子的发芽率急剧下降,高浓度EMS处理的发芽率显著低于低浓度和CK,说明EMS对草莓萌发种子的毒害作用显著,可能是因为萌发种子的幼芽更容易吸收药剂,受到的毒害作用更强。在相同浓度下,随着处理时间延长,草莓萌发种子的发芽率下降,在EMS浓度为1.0%、处理时间为16 h时,草莓萌发种子全部致死;在EMS浓度为0.4%和0.6%、处理时间为16 h时,种子的发芽率分别为56.33%和45.33%,接近半致死剂量,可用作EMS诱变条件之一,但鉴于萌发状态的种子嫩芽移栽时容易人为损伤,不推荐大批量应用。

表4 EMS不同浓度和处理时间草莓萌发种子的发芽率

3 讨论

种子作为植物最基本的生殖器官,可以在诱变前后较长时间保存自身活性以及诱变所致的变异基因,而且试验在常规环境下即可进行操作,诱变程序简单易行,虽然存在滞后性,诱变的性状差异需要在M2、M3代得以表达,但是所能表现出来的差异性状往往可以遗传,从而可以免去后期相关鉴定程序[14]。研究表明,不同状态的草莓种子对EMS的敏感度不同,分析可能原因:一是EMS与水溶液混合后会产生有毒物质。EMS的生产方法一般是通过甲磺酸和乙醇反应,甲磺酸能引起植物明显损伤和不育,有毒物质对不同萌发状态种子种皮的渗透能力不同,因而导致不同状态种子的发芽率不同。二是成熟种子的胚细胞被许多有活力的细胞包围,再加上细胞膜的选择透过性会阻碍EMS进入胚细胞[15-16]。因此,EMS相同浓度处理时间不同,发芽率不同,尤其是高浓度处理中,随时间延长,有毒物质对膜的损伤加剧,导致发芽率下降。

在化学诱变育种中想要获得有效的诱变效果,需要确定适宜的诱变剂量,既能达到最高的变异率和较宽的变异谱,又不能过分地损伤植株,是确定植物适宜诱变剂剂量的重要指标;过高的化学诱变浓度会提高突变率,但容易导致植物死亡率升高,并会因细胞严重受损而造成不良突变的增加,从而掩盖其他的突变,不利于有利突变性状的产生,影响化学诱变效果[17]。本研究中,EMS诱变对草莓种子的发芽率在不同处理时间和浓度以及不同种子萌发状态上均存在差异,表明草莓种子对EMS处理存在敏感性,各处理组合不是单因素简单相加,只有在合适的浓度和时间组合下才能得到适宜的处理条件[18]。研究表明,草莓萌动种子在EMS浓度0.8%、处理时间12 h时萌发率下降至50%左右,达到半致死剂量,可作为试验筛选的诱变条件。与胡志峰等[19]对金花菜种子上的研究,即EMS诱变浓度抑制效应在一定程度上大于诱变时间的结论一致。本试验仅研究了EMS对八倍体“津韵1号”草莓种子萌发率的影响,以半致死剂量为参考,确定EMS诱变草莓种子的最佳条件,试验中所获得的植株是否在分子层面发生了变异还有待考证。

4 结论

不同吸水程度和萌发状态的草莓种子对EMS的敏感度不同,在处理中应根据种子大小、种皮厚度、种子发芽势等指标确定最适合种子诱变的萌动状态。EMS诱变对草莓种子的发芽率在不同处理时间和浓度以及不同种子萌发状态上均存在差异,各处理组合不是单因素简单相加,只有在合适的浓度和时间组合下才能得到适宜的处理条件,在处理中应根据实际需要的诱变效果选择诱变条件。本试验条件下,萌动种子在EMS浓度为0.8%,处理时间为12 h,草莓种子的发芽率接近半致死剂量,确定为EMS诱变草莓种子的最佳条件。