超声辅助有机酸预处理玉米芯制取生物乙醇的工艺优化

于德涵, 朱颖怡, 黎 莉, 武海玲

(绥化学院 食品与制药工程学院, 黑龙江 绥化 152061)

0 引言

【研究意义】能源是推动世界各国社会和经济发展的基础动力,尤其是在石油紧缺现状下能源问题已成为影响世界安全稳定的重要因素。燃料乙醇是现阶段广泛使用的生物质燃料,普遍添加于多种石油制品中。利用微生物将木质纤维素中的纤维素成分分解成单糖或寡糖用于发酵被认为是燃料乙醇最经济、最环保的生产方式。我国是世界第二大玉米种植和生产国,每年玉米加工会产生超过7 000万t的玉米芯,这些玉米芯大多数被当作废弃物丢弃或者燃烧,利用率不足年产量的20%[1]。玉米芯是典型的木质纤维素原料,其能量密度较玉米秸秆和柳枝稷更高,能达到5 000 kJ/m3[2],在燃料乙醇生产方面更具优势。利用玉米芯发酵生产乙醇,不仅能够缓解我国的能源压力,还能减少因玉米芯的不当处理造成的环境污染,大幅提高玉米芯的附加值。【前人研究进展】玉米芯中纤维素被半纤维素和木质素紧密包裹和覆盖,导致纤维素酶可及性差[3],纤维素的糖转化率低,这成为制约利用玉米芯发酵生产燃料乙醇的技术瓶颈。打破瓶颈的关键是采用一些方法对玉米芯预先进行处理,消除纤维素表面的物理或化学屏障,使微生物产生的纤维素酶能够和底物结合,水解糖化后进行发酵[4]。目前,对木质纤维素预处理的方法主要有使用硫酸或硝酸酸处理法、使用氢氧化钠溶液的碱处理法和物理法。酸、碱处理法对设备的耐腐蚀要求高,且强酸、强碱对环境污染严重,环境治理成本高;物理法即蒸汽爆破法,此法需要专用设备且能量消耗大,不利于扩大生产。【研究切入点】有机酸是目前较受欢迎的用于预处理木质纤维素的试剂。有机酸法既不需要蒸汽爆破法高能耗的大型机械设备,更没有像采用强酸、强碱预处理时对设备高耐腐蚀性的要求,对环境相对友好,也不会在预处理后产生对后续发酵有抑制作用的化合物[5-6]。目前,超声辅助有机酸预处理玉米芯木质纤维素的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选择酸性相对较低的柠檬酸辅以超声对玉米芯进行预处理,并采用酶和微生物共同分解的方式发酵生产乙醇,以期开发出一种处理效果好、乙醇产量高的玉米芯预处理工艺,为玉米芯的综合应用和燃料乙醇产业的发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米芯(先玉335),采自黑龙江省绥化市北林区;纤维素酶(食品级),河南俊一生物科技有限公司提供;酿酒酵母(干),由绥化学院发酵实验室保藏;其他试剂皆为国产分析纯。

UV-759型分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;JY92-IIDN型超声波仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;FW100型粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;HH-M6型恒温水浴锅,江苏春兰科学仪器有限公司;PHSJ-5型酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;TDL-60B型台式离心机,上海安亭科学仪器厂;LS-50HD型数显立式灭菌器,山东博科控股集团有限公司;SX2-1-12TP型马弗炉,上海卓的仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米芯前处理 将清洗干净的玉米芯烘干,粉碎过40目筛,粉末干燥至恒重,密封保存备用。

1.2.2 玉米芯纤维素、半纤维素和木质素含量测定 称取1.0 g玉米芯粉末与50 mL蒸馏水混匀,在沸水浴中保温30 min,抽滤去滤液,滤渣用丙酮清洗后再用蒸馏水清洗;滤渣加入50 mL 2 mol/L盐酸溶液沸水浴中保温40 min后抽滤,滤液测半纤维素质量;滤渣用蒸馏水洗涤至pH 7.0左右,加入5 mL浓度为72%的硫酸溶液于25 ℃水解3 h,加水45 mL混匀后抽滤,滤液测纤维素质量[7-8];残渣于80 ℃烘干后称重记为W,再用马弗炉于550 ℃灰化后测定残余灰分质量W1,测定木质素质量。

C1=(m葡萄糖×0.9/m样品×1 000)×100%

C2=(m木糖×0.88/m样品×1 000)×100%

C3=(W-W1)/m样品×100%

式中,C1为纤维素比率(%),C2为半纤维素比率(%),C3为木质素比率(%),m葡萄糖为标准曲线法测得葡萄糖含量(mg),m木糖为标准曲线法测得木糖含量(mg),m样品为样品质量(g),0.9为葡萄糖转化为纤维素的转化系数,0.88为木糖转化为半纤维素的转化系数,下同。

1.2.3 超声辅助有机酸预处理 称取1.0 g玉米芯粉末于50 mL三角瓶中与10 mL浓度为5%柠檬酸溶液混合均匀,超声处理(60 ℃、200 W、20 min)后,1 000 r/min离心10 min,上清液测木糖含量,计算半纤维素脱除率;沉淀用蒸馏水冲洗2次,加入一定量pH 4.8缓冲液和纤维素酶于50 ℃水解24 h,测定葡萄糖含量,计算纤维素还原糖转化率。

R半纤维素=(m1木糖×0.88/m样品×1 000)×100%

T=(m1葡萄糖×0.9/m样品×1 000)×100%

式中,R半纤维素为半纤维脱除率(%),T为纤维素还原糖转化率(%),m1木糖为上清液中木糖质量(mg),m1葡萄糖为酶解液中葡萄糖质量(mg)。

1.2.4 预处理条件单因素试验 以柠檬酸浓度(1%、2%、5%、10%和15%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1,液料单位为mL/g)、超声功率(100 W、200 W、300 W、400 W和500 W)、超声温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃)和超声处理时间(5 min、10 min、20 min、30 min和40 min)为试验因子开展单因素试验,考察各因子的适宜水平。进行单一因素的不同水平试验时,其他因素水平和操作同1.2.3。

1.2.5 预处理工艺优化 根据1.2.4试验结果及其显著性分析,以还原糖转化率为响应值(Y),选择合适的响应因素和水平进行Box-Behnken设计,采用响应面分析确定最佳预处理工艺。具体响应因素和水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素设计与编码

1.2.6 酶解操作优化 1.0 g玉米芯粉末经最优预处理条件处理后,取沉淀物加入一定量的纤维素酶(10 FPU/g、20 FPU/g、30 FPU/g、40 FPU/g和50 FPU/g)和20 mL、pH 4.8的缓冲液,于50 ℃水解72 h,中途于不同时间取样8次,分别测定水解液中还原糖含量。纤维素酶活测定参照GHOSE[9]的方法。

1.2.7 不同发酵方式对乙醇产量的影响试验

1) 酵母活化。将干酵母和2%麦芽糖溶液以1∶20比例加入碘量瓶中混匀,在37 ℃水浴中保温30 min。此溶液用于发酵接种,接种量为5%,接种前摇匀。

2) 分步发酵。10.0 g玉米芯经预处理和酶解后,上清液中加入1 g蛋白胨,高温灭菌(108 ℃、15 min),接种后于30 ℃、150 r/min振荡发酵,测定发酵液中乙醇含量。

3) 半同步发酵。10.0 g玉米芯经预处理后加入1 g蛋白胨,高温灭菌后用无菌Ca(OH)2溶液调pH 4.8,加纤维素酶于50 ℃水解4 h,接种,发酵操作同上。

4) 同步发酵。10.0 g玉米芯经预处理后加入1 g蛋白胨,高温灭菌后调溶液pH 4.8,接入纤维素酶和酵母液,发酵操作同上。

上述每种发酵方式单次试验4个平行同时进行,从发酵60 h起,每间隔12 h测定1个发酵瓶中乙醇含量,并计算乙醇得率。乙醇含量测定参考徐绣艳等[10]的方法。

Y乙醇=(D乙醇×V/m样品×C1×1.11×0.51)×100%

式中,Y乙醇为乙醇产率(%),D乙醇为乙醇质量浓度(g/L),V为发酵液体积(L),C1为纤维素比率(%),1.11为纤维素转化为葡萄糖的转化系数,0.51为乙醇转化为葡萄糖的转化系数。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0和Microsoft office excel 2016进行单因素试验数据处理,Design expert 8.0.6进行响应面试验设计与分析。所有试验数据均取3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 玉米芯主要成分

由图1可知,玉米芯3种主要组成成分中,纤维素占比最高,达37.55%;其次是半纤维素,占29.03%;木质素含量最低,占26.10%;另外玉米芯中还含有4.36%的灰分和2.96%的其他物质。

图 1 玉米芯主要成分比例

2.2 玉米芯预处理各因素适宜水平的选择

通过半纤维素脱除率和纤维素糖转化率评价各因素不同水平对玉米芯预处理的效果(图2)。

2.2.1 柠檬酸浓度 柠檬酸浓度在1%～10%范围内,半纤维素脱除率和纤维素糖转化率随柠檬酸浓度升高而升高,在柠檬酸浓度达10%时,二者均达最高值,但与柠檬酸浓度5%时相比无显著提升;柠檬酸酸浓度15%时纤维素糖转化率小幅度降低。这是因为随酸浓度增加,半纤维素的酸水解作用加强,木质素、半纤维素和纤维素之间的化学键在酸作用下断裂,破坏木质纤维素结构[11],有助于纤维素酶与纤维素接触,从而提升还原糖转化率;但酸浓度过高,少部分纤维素在预处理时分解,导致后续酶解时还原糖量减少。另外,柠檬酸浓度大,成本较高,且不利于后续对柠檬酸的回收或转化。因此,玉米芯预处理选择5%作为柠檬酸适宜浓度。

2.2.2 液料比 在低液料比[(10∶1)～(20∶1)]条件下,半纤维素脱除率和纤维素还原糖转化率随液料比增加而升高,当液料比为20∶1时,半纤维素脱除率最高,达29.22%;继续提高液料比,半纤维素脱除率无显著变化;纤维素还原糖转化率也在液料比20∶1时达最大值,但此值相较于液料比15∶1处理其纤维素还原糖转化率无显著差异。虽然较高液料比的预处理有助于半纤维素分解后生成的木糖、寡聚木糖等成分溶解,使内部的纤维素成分暴露出来易于酶解,液料比达15∶1时,半纤维素即使还有部分未水解,但水解部分已经能给纤维素酶和纤维素的结合提供足够的通道和位置[12],此时纤维素能充分酶解,糖转化率高;液料比继续增大糖转化率无显著提升。因此,结合半纤维素脱除率和纤维素还原糖转化率,选择20∶1作为最佳液料比。

注:同一指标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2.3 超声功率 超声波主要利用空化效应和热效应作用于木质纤维素,其不但能促进半纤维素的水解,还能使木质素分子间的结构发生变化,暴露出被覆盖的纤维素,增强酶与纤维素的接触和作用;另外,超声对维持纤维素内结晶结构的化学键产生破坏作用,使纤维素结构松散,更易于其在内部结合纤维素酶,促进酶解效果[13]。半纤维素脱除率和纤维素还原糖转化率随超声功率的增大呈先升后趋平稳再缓降趋势,均在功率为400 W时达到峰值。这是由于低超声功率时,其超声作用不强;增强超声功率后,对木质纤维素的破坏能力随之加强,故酶解糖转化率提升;当超声功率进一步增强时(超过400 W),体系中因出现更多空化泡而产生消能作用[14],使超声对木质纤维素的破坏减弱,更高超声功率还会导致纤维素在预处理阶段发生一定程度的酸水解,进一步降低还原糖的转化率。综合分析认为,400 W为最佳预处理超声功率。

2.2.4 超声温度 在预处理温度范围内(50～90 ℃)时,玉米芯半纤维素脱除率随温度升高而提高,90 ℃处理显著高于除80 ℃外的其他处理,80 ℃与70 ℃处理差异不显著,与50 ℃、60 ℃处理的差异显著。纤维素糖转化率在70 ℃达最高值,且显著高于50 ℃、60 ℃处理,而与80 ℃、90 ℃处理差异不显著。温度对于柠檬酸溶液在超声环境下处理玉米芯有积极作用,高温更有助于半纤维素成分酸水解[15],提高预处理效果,所以纤维素的糖转化率随温度升高而升高;但当温度过高时,暴露出的纤维素水解风险增加,故导致最后糖转化率有下降趋势。综合分析认为,预处理温度选择70℃最宜。

2.2.5 超声时间 纤维素还原糖转化率随超声作用时间延长先显著上升,超过30 min后又显著下降。超声作用时间短时(5～20 min),半纤维素水解不充分,超声能量对木质纤维素的破坏作用不强,所以酶的可及性差,纤维素的还原糖转化率低,其变化趋势和半纤维素的脱除率趋势基本相同;随着超声时间的延长(20～30 min),空化效应随着能量的累积逐渐增强[16],预处理效果也随之加强,但是纤维素随着超声作用时间的延长会增加被酸水解的风险,所以超声处理时间超过30 min后,纤维素酶水解后还原糖得率会下降。综上,超声预处理时间选择30 min最有利。

2.3 玉米芯预处理条件优化

2.3.1 回归模型建立与显著性检验 为保证模型最佳点的稳定性,依据Box-Behnken设计包含有5个中心点的总计17组试验,设计及结果见表2。对数据进行二次多项式回归拟合,得回归方程Y=36.60-0.44A+2.22B+1.32C-1.65AB+0.44AC-0.38BC-1.45A2-2.81B2-1.48C2。方差分析结果(表3)可知,回归模型P<0.000 1,表明该模型可靠程度高;R2=0.980 8,校正系数R2Adj=0.956 2,失拟项P=0.758 9>0.05(不显著),表明模型误差小,拟合度高,试验误差对结果影响较小,拟合值与试验结果高度相关。模型的变异系数(CV)为1.73%,信噪比(精密度值,Adeq Precision)为18.33,表明模型的试验精度高、可靠性好,模型能真实地反映试验结果。在各考察因素中,对还原糖得率影响最大的是B因素(超声温度),其次为C因素(超声时间),超声温度和超声时间对水解后还原糖得率影响达显著或极显著水平;影响最小的是A因素(超声功率)。

表2 Box-Behnken试验设计不同因素水平组合玉米芯的还原糖转化率

表3 回归模型的方差分析与显著性检验

2.3.2 数学模型及响应面分析 由图3可见,在超声功率(A)、超声温度(B)、超声时间(C)3个因素中任意2个因素交互作用时,还原糖转化率皆随某一因素的增加呈先升后降趋势。影响还原糖得率的各交互作用因素中,AB(P=0.000 8)交互作用最强,而BC(P=0.238 8)最弱。

图3 不同因素交互作用处理玉米芯的还原糖转化率

2.3.3 最优预处理条件验证 利用Design Expert 8.0.6对数据进行优化得到最佳预处理工艺:超声功率362.11 W、超声温度74.84 ℃、超声时间33.29 min,还原糖得率理论预计值为37.43%。在验证试验中,考虑操作的可实现性,将玉米芯预处理操作工艺参数调整为5%柠檬酸与玉米芯粉末以20∶1(mL/g)比例混匀,在功率360 W、温度75 ℃条件下超声处理33 min后酶水解,最终还原糖得率实际平均值为36.71%,与软件模拟预测值误差为1.9%,实际与模型优化符合良好,证实优化条件有效、可靠。

2.4 玉米芯预处理酶解条件优化

在纤维素酶不同用量处理条件下,以玉米芯还原糖转化率达最大值的酶解时间为依据,判断不同酶用量的酶解效果。从图4看出,当纤维素酶用量为10 FPU/g时,因酶用量少,需要72 h才能完成水解,提高酶用量后,水解完成时间会缩短;当酶用量达到30 FPU/g,36 h即基本完成水解,再增加酶用量,不会进一步缩短酶解时间,所以酶解时纤维素酶的最佳用量为30 FPU/g。

图4 不同酶用量及酶解时间处理玉米芯的还原糖转化率

2.5 不同发酵方式处理玉米芯的乙醇产率

由图5可知,分步和半同步2种发酵方式均在72 h时乙醇的产率最高,分别为70.08%和70.32%,二者无显著差异;再延长发酵时间,乙醇产率反而降低;同步发酵的乙醇最高产率出现在发酵84 h时,为70.19%,同另2种发酵方式的乙醇产率峰值无显著差异,延长发酵时间,乙醇产率轻微降低。这是因为采用分步发酵或半同步发酵时,培养液中因酶水解纤维素产生还原糖,在接种量相同情况下,有助于缩短延迟期;另外,前期充足的碳源有助于酵母菌快速增值,从而缩短发酵周期,更快达到发酵平衡[17];乙醇产率达最大值后继续发酵,酵母会在葡萄糖耗尽缺少碳源的情况下利用乙醇作为碳源用于自身生长,所以会导致乙醇产率少量降低。综上,半同步发酵法乙醇产率与分步和同步发酵方法相当,但耗时最短,效率最高。

图5 不同发酵方式及发酵时间处理玉米芯的乙醇产率

3 讨论

木质纤维素的预处理利用强酸、强碱等试剂,虽能取得较好的预处理效果,但对设备要求高、环境污染较为严重;利用对环境相对友好的有机酸,通常需要更高的温度。BARISIK等[18]在使用马来酸和草酸对麦秸进行预处理和发酵时,需要210 ℃的高温;乔慧等[19]利用乙酸预处理玉米芯时,最优预处理温度需要160 ℃、60 min。在酸性较强的高温条件下,虽然能较好地促进半纤维素水解,使纤维素暴露出来,但导致纤维素在高温酸性环境下分解,造成纤维素组分流失,糖转化率降低,使后续发酵生物量减少,乙醇产量降低。

超声波处理材料是利用超声波空化泡在崩溃的瞬间,在材料周围产生局部高温、高压及强烈的冲击波,对预处理材料产生空化效应的同时,伴随热效应、机械效应、热解和自由基效应等综合作用,能破坏材料的结构,促使其内容物快速释放。超声波有利于木质素-纤维素和木质素结构单元之间连接键的断裂,促使木质素致密的网格分解,在不影响纤维素有序性的情况下增加其有效表面积;采用超声波预处理植物原料也有利于木质素与半纤维素之间的强连接键的破坏[20]。康广博[21]比较了超声波-酸、超声波-碱预处理与单纯酸、碱预处理对稻草化学组成的影响发现,经过超声波强化预处理的原料,半纤维素和木质素脱除率更高,纤维素损失更少,达到发酵所需的还原糖浓度的酶解时间也更短。WANG等[22]研究了超声-Feton预处理法对玉米芯结构的影响,结果表明,有超声辅助的Feton法能更好地溶解木质素,在底物表面形成更容易被酶结合的区域与空隙,纤维素转化率达到理论值的90.34%,该值远高于单独Feton法预处理的纤维素转化率。SUBHEDAR等[23]以花生壳、椰子壳和开心果壳为原料,分别采用常规碱预处理和超声波-碱预处理,对比发现超声辅助在降低碱液浓度、增加脱木素率、减少处理时间和增加还原糖产率等方面有显著强化作用。采用半同步法发酵乙醇的产率为70.32%,该值较刘彬等[24]报道的碱法预处理玉米芯制备乙醇的产率提高13.60%。综上,超声波法操作简便、高效、环保,与其他方法结合,可以降低化学药品浓度和污染负荷,减少发酵抑制物的生成,利于后续酶解效率和发酵乙醇的产量。

4 结论

采用有机酸结合超声辅助对玉米芯进行预处理,采用纤维素酶和酵母菌共同分解、发酵生产乙醇。经过对预处理工艺、酶解条件和发酵方式的优化,最终得到玉米芯生产乙醇的最优预处理酶解工艺:5%柠檬酸与玉米芯粉末以液料比20∶1(mL/g)混合均匀,在功率360 W、温度75 ℃条件下超声处理33 min后酶水解,还原糖得率可达36.71%,该值与玉米芯中纤维素含量相当;此条件下,添加纤维素酶30 FPU/g,采用半同步法发酵乙醇的产率为70.32%,高乙醇产率分别是70.08%和70.19%,与半同步发酵的乙醇产率无显著差异。

本工艺采用有机酸辅以超声预处理玉米芯后,使用酶与微生物共同作用的方法制备生物乙醇,既大幅降低了常规预处理工艺中使用强酸对环境的严重污染和对耐腐蚀设备的要求,又避免了工艺中对高温、高压的需求,是一种安全、经济的预处理玉米芯发酵制取生物乙醇技术。