耐盐碱解磷菌的筛选鉴定及对绿豆的促生作用

周 妍，王丽娜，张美珍，刘 权，殷奎德

(1. 黑龙江八一农垦大学 植物微生物互作实验室，黑龙江大庆 163319；2. 黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江大庆 163316)

磷是植物生长发育过程中必要的矿质元素之一，在植物生长过程中，参与核酸、磷脂和ATP的合成，还能通过光合作用、生物氧化和细胞分解代谢等途径促进植物生长[1]。当缺磷时，核酸的合成受到影响，细胞的形成和增殖也会受到抑制，导致植株根系发育不良，长势矮小，严重时植株发育停滞。据统计，中国农田磷缺乏比较严重，大约有2/3的农田处于缺磷状态，土壤中有效磷平均含量仅有0.1%，严重影响植物生长和作物产量[2]，因此农民常施入大量含磷的化肥来解决土壤缺磷问题，但以化肥形式进入土壤的磷，至少有80%成为难以被作物吸收利用的固定形态，磷利用率过低。盐碱土壤中含有大量盐碱成分，有效磷含量少，致使大多数植物的生长受到不同程度的抑制[3]。耐盐碱植物可以在中度盐碱条件下生存，根际可能会有高效解磷菌的存在，从耐盐碱植物的根际分离得到的耐盐碱解磷菌会更适应盐碱环境。张振等[4]从植物根际土壤中筛选得到菌株ZZ21，发现该菌能够耐盐碱，解磷，在pH为10，含盐度为7mol/L的LB培养基上能够生长，30℃培养72h对磷酸三钙液体培养基的溶磷量达120.86mg/L。张巍等[5]从黑龙江省安达地区羊草根际盐碱土中分离得到两株解磷含量较高的菌株，分子鉴定为乙酸钙不动杆菌和近平滑假丝酵母，并在NaCl浓度10mol/L条件下有较高的溶磷量。杨海霞等[6]从天津滨海新区盐碱土壤中分离得到1株耐盐碱溶磷菌Y2R2，分子鉴定结果表明该菌为盐单胞菌属(Halomonas)的一个新种，发现该菌在pH=13和NaCl浓度12mol/L的条件下，溶磷量达到167.9mg/L。目前已知的具有解磷能力的菌株种类大多为盐单胞菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等，而对于本研究分离得到的不动杆菌属及微杆菌属菌在耐盐碱解磷方面的功能未见报道。

本研究以盐碱地上生长的盐生植物羊草和碱蓬根际土为材料，从中筛选分离得到多株具有解磷功能的菌株，挑选解磷能力较强，同时具有其他促生特性的菌株进行鉴定，利用盆栽试验验证解磷菌对绿豆的促生效果，以期为进一步研究耐盐碱解磷菌的解磷机制、研制耐盐碱解磷生物菌剂产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 分离促生菌土壤样品 两种耐盐碱植物根际土壤样品于2020-07-12采集。羊草土壤样品取样地点位于黑龙江省大庆市龙凤区的盐碱土草原(46°36′23″ N，125°10′44″ E)，取样时采用五点取样法，每点之间距离1 m；碱蓬土壤样品采集地点位于黑龙江省大庆市开发区一处只生长碱蓬的区域(46°28′20″ N，125°15′41″ E)，取样时挖取5株碱蓬植株。采集土壤样品时使用铁锹挖取地面0～20 cm土层土样，将大块土抖落下去，用刷子轻轻刷下附着于根际表面的土壤，分别将羊草和碱蓬根际土壤样品混合均匀，装于无菌袋中，运回实验室后4 ℃保存，待用。

羊草和碱蓬的根际土壤理化性质如表1所示。

表1 羊草和碱蓬根际土壤理化性质

1.1.2 培养基及Hogland全营养液 筛选菌株的蒙金娜有机磷培养基和PKO无机磷培养基参考赵小蓉等[7]的方法进行配制；阿须贝无氮培养基参考何建清等[8]的方法进行配制；解钾培养基参考吴俊林等[9]的方法进行配制；LB培养基参照Baev等[10]的方法进行配制；ADF培养基参照Gao等[11]的方法进行配制，CAS铁载体检测培养基参考Schwyn[12]的方法进行配制。

Hogland全营养液的配制方法按照陈超等[13]的方法配制，其中缺磷营养液的配制是将Hogland正常营养液中的磷酸铵换成氯化铵，其余均不变。

1.1.3 绿豆试验品种 试验使用的绿豆品种为‘小明绿’，由国家杂粮工程技术研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分离纯化 分离菌株按照Sarkar 等[14]的方法进行筛选，先在有机磷固体培养基上筛选解磷菌，再在无机磷培养基上筛选解磷菌。将筛选的菌株划线培养传代至少3次以上，直至获得纯化菌株，-80 ℃保存菌株用于后续试验。

1.2.2 菌株溶磷功能的测定 在蒙金娜有机磷培养基和PKO无机磷培养基上接种50 μL菌悬液，置于28 ℃恒温培养箱中，倒置培养7 d，观察菌株是否产生透明溶磷圈，测定细菌菌落直径(D)与所形成的溶磷圈直径(d)，计算溶磷指数(Phosphate solubilizing index，PSI)，通过D/d来初步判断菌株溶磷能力强弱[15]；在蒙金娜有机磷液体培养基和无机磷液体培养基上接种纯化后的解磷菌，将菌悬液的浓度调到1×108CFU/mL。28 ℃、160 r/min条件下振荡培养7 d，用钼蓝比色法[16]和钼锑抗比色法[17]对上清液中有机磷量和无机磷量进行测定。

1.2.3 菌株其他促生功能的测定 固氮功能，解钾功能，分泌植物激素IAA，产ACC脱氨酶活性和产铁载体能力的鉴定分别按照文献[18-22]的方法进行鉴定。

1.2.4 菌株的生理生化鉴定和分子生物学鉴定 生理生化测定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[23]进行鉴定。主要包括吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验、淀粉水解试验、产氨试验、厌氧生长试验及脓青素试验等指标，其中所有生理生化所用的试剂均自行配制。

菌株总DNA通过细菌基因组DNA提取试剂盒[24]来提取，PCR扩增时使用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系如下：2×EsTaq Master Mix 25 μL，DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加dd H2O至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。得到产物后，纯化回收，送至库美生物科技有限公司测序。将反馈的结果在NCBI上进行BLAST分析，然后通过MEGA 7.0对序列进行Clustal W比对，通过邻接法构建系统发育进化树，最后确定菌株的分类学地位。

1.2.5 解磷菌株耐盐碱试验 耐盐试验:按照沈萍[25]的方法进行测定。首先在LB液体培养基中摇种子液，使菌液的OD600为0.6，此时按1%的接种量接种到不同盐浓度梯度(1、3、5、7、9、11 mol/L)的LB培养基中，将接种后的培养基置于37 ℃、180 r/min的摇床中培养，每隔24 h测OD600值，测定7 d。

耐碱试验:按照潘媛媛等[26]的方法进行测定。首先在LB液体培养基中摇种子液，使菌液的OD600为0.6，按1%的接种量接种到不同pH梯度(pH=8、9、10、11、12)的LB培养基中，将接种好的培养基置于37 ℃、180 r/min的摇床中培养，每隔24 h测其OD600值，测定7 d。

1.2.6 耐盐碱解磷菌对绿豆促生试验 用于绿豆盆栽试验的土壤采集自大庆市植被生长较好的盐碱地草原，pH 8.74，可溶性盐含量1.5 mol/L，碱解氮、速效钾和有效磷含量分别为98.00、 378.00、18.20 mg/kg，有机质含量为31.60 g/kg。沙子用水清洗3遍后烘干，再将取回的新鲜盐碱土与沙子1∶1等体积混匀装入盆中，每盆沙土质量5 kg。

盆栽试验中的植株样品设定两个对照组(CT1和CT2)和3个接种不同菌株的处理组(T1、T2和T3)，重复3次。具体为：缺磷营养液(CT1)、正常营养液(CT2)，JC8+缺磷营养液(T1)、JC11+缺磷营养液(T2)，JP8+缺磷营养液(T3)；为了区分植株样品和土壤样品，土壤样品命名为缺磷营养液(SCT1)、正常营养液(SCT2)，JC8+缺磷营养液(ST1)、JC11+缺磷营养液(ST2)，JP8+缺磷营养液(ST3)。JC8和JC11是从羊草中分离得到的解有机磷含量高的菌株，JP8是从碱蓬中分离得到的解有机磷含量高的菌株，菌液的配制方法按照Kwak 等[27]的方法进行制备，Hogland营养液选择1/4倍进行浇灌，共浇2次，每次200 mL。先施入1/4 Hogland营养液200 mL和浓度为107CFU/mL的菌液后种植绿豆，每盆30株，置于室外培养36 d测定绿豆的各项生长指标。17 d后再施入一次浓度为107CFU/mL的菌液和1/4 Hogland营养液200 mL。

采用叶绿素测定仪测定绿豆叶片的叶绿素含量(SPAD值)；绿豆植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及丙二醛(MDA)含量的测定参照彭亮等[28]的方法进行；绿豆幼苗可溶性糖含量、可溶性蛋白和脯氨酸含量测定参照李合生[29]的方法。

1.2.7 土壤酶活性的测定 绿豆生长35 d以后取根际土壤用作土壤酶活性的测定。

土壤酶活性(脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、纤维素酶、过氧化氢酶)参照Zhao等[30]的方法测定。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据分析处理，方差分析采用Duncan’s新复极差法和LSD法，采用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 解磷菌的分离与解磷能力分析

取羊草和碱蓬根际土用有机磷和无机磷培养基筛选解磷菌，最终得到100株不同菌落形态的解有机磷和无机磷菌株。通过对菌株解磷圈[溶磷圈直径(D)/菌落直径(d)]的测定选出较大的30株菌进行解磷量的定量6 d测定，其中JC8、JC11和JP8这3株菌株解有机磷能力较强(图1)，解有机磷含量分别为414.18 mg/L、482.86 mg/L和428.30 mg/L，解无机磷含量分别为 3.98 mg/L、9.11 mg/L和7.58 mg/L。通过菌株解磷圈和解磷含量判断该菌解磷能力较强，最终选取这3株菌用做后续试验。

图1 3株菌株解磷含量

2.2 菌株的其他促生功能鉴定

通过解磷量选出3株高效解磷菌株，以解磷功能为主，又对菌株进行其他促生功能的鉴定，结果如表2所示。由表2可见，这3株菌株均具有固氮、解钾、产IAA、ACC以及铁载体的功能；其中JC8产ACC能力更强，而JC11产IAA能力更强。

表2 3株菌的其他促生功能

2.3 菌株的生理生化特性和分子学鉴定

对3株耐盐碱高效解磷菌进行生理生化鉴定，如表3所示，发现3株菌株均能在唯一碳源、氮源条件下生长；吲哚试验、接触酶试验、淀粉水解、厌氧生长、硝酸盐还原和产氨试验均呈阳性；而V-P试验均呈阴性。

表3 3株菌的生理生化特性

提取JC8、JC11和JP8 3株解磷菌的DNA再进行测序，然后将得到的16S rRNA基因序列两端冗余序列删除，在NCBI上进行BLAST分析，并通过MEGA构建发育树，根据与模式菌株的相似性判断菌株的种属分类。结果如图2和表4所示，根据生理生化试验和16S rRNA鉴定结果，最终判定JC8、JC11和JP8分别为假单胞菌属(Pseudomonassp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)和微杆菌属(Microbacteriumsp.)。

图2 3株菌株基于16S rRNA基因的系统发育树

表4 3株菌的 16S rRNA 基因相似性比对结果

2.4 解磷菌株耐盐碱测定试验

将菌株分别接种于不同含盐量和pH的LB液体培养基中，每隔24 h对3株菌株的OD600值进行测定，共测定7次，记录7 d中吸光值最高的数值，随着氯化钠浓度和pH的上升，3株菌株吸光值的结果均呈现上升的趋势，但第5天后，3株菌株的吸光值上升缓慢，基本维持稳定，耐盐试验和耐碱试验结果如表5所示，发现JC8和JP8能在pH=11和氯化钠含量为9 mol/L的条件下生长，JC11能在pH=11和氯化钠含量为11 mol/L的条件下生长，说明3株菌株均具有较强耐盐和耐碱的能力[31-33]。

表5 3株菌株耐盐和耐碱试验

2.5 高效耐盐碱解磷菌对绿豆幼苗生长的影响

选取3株耐盐碱高效解磷菌进行绿豆的促生试验，用缺磷土壤种植绿豆，36 d测定绿豆的各项生长指标，统计分析结果如表6所示。接种不同的菌株以后，绿豆幼苗的根长、植株鲜质量以及根鲜质量含量均显著增加(P<0.05)，T1、T2和T3与CT1相比根长分别增加163%、239%、240%；植株鲜质量分别增加191%、339%、480%；根鲜质量分别增加230%、197%、300%。T1、T2和T3与CT2相比根长分别增加66%、209%、240%；植株鲜质量分别增加84%、300%、480%；根鲜质量分别增加108%、171%、300%。表明接种解磷菌后，土壤中难溶的磷酸盐被菌株分解为可供植物吸收利用的磷，显著改善绿豆在盐碱土中的生长状况，缓解了盐碱胁迫对绿豆生长造成的抑制作用，增强了绿豆对盐碱胁迫的抵抗能力。

表6 不同处理绿豆植株形态指标

对绿豆叶片的抗氧化酶以及渗透性物质进行测定，从表7发现接种菌株以后的绿豆叶片抗氧化酶酶活性与CT1和CT2相比均显著下降(P<0.05)，其中POD的下降趋势最大，T1、T2和T3与CT1相比，分别下降143%、207%、107%；T1、T2和T3与CT2相比，分别下降50%、90%、28%；由此说明解磷菌除溶磷功能外，还具有其他促生功能，能够缓解盐碱对绿豆的伤害；由表8结果可知接种菌株的绿豆叶片中渗透性物质与CT1和CT2相比均显著上升(P<0.05)，其中可溶性糖和脯氨酸含量上升很大，T1、T2和T3与CT1可溶性糖含量相比分别增加98%、87%、115%；T1、T2和T3与CT1脯氨酸含量相比分别增加了144%、200%、225%；T1、T2和T3与CT2可溶性糖含量相比分别增加78%、68%、93%；T1、T2和T3与CT2脯氨酸含量相比分别增加41%、74%、88%；说明施入解磷菌后，增加了绿豆渗透调节物质的含量，维持了细胞的渗透平衡，减轻胁迫对植株的伤害。

表7 不同处理绿豆叶片酶活性

表8 不同处理绿豆叶片渗透性物质

2.6 高效耐盐碱解磷菌对土壤酶活性的影响

室外培养绿豆的第36天，对种植绿豆的5组不同的根际土壤进行土壤酶活性测定，统计分析结果如表9所示。ST1、ST2和ST3与SCT1相比，脲酶分别显著增加71.8%、85.6%、84.4%，蔗糖酶分别显著增加41.0%、41.5%、46.0%，磷酸酶分别显著增加23.6%、28.1%、 25.3%，过氧化氢酶分别增加5.7%、7.2%、7.1%；ST1、ST2和ST3与SCT2相比，脲酶分别显著增加 44.4%、 55.6%、54.2%，蔗糖酶分别显著增加22.2%、22.2%、22.2%，磷酸酶分别显著增加14.6%、18,8%、16.2%，过氧化氢酶分别显著增加 4.9%、6.8%、6.2%。说明接种解磷菌株以后，能够提高土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、纤维素酶、过氧化氢酶的活性，改善了土壤肥力。

表9 土壤酶活性

3 讨 论

松嫩平原是中国盐碱土主要分布区之一，由于盐碱土壤环境为高盐强碱且较为瘠薄，养分含量低，多数植物和微生物难以在其中生存。本研究从两种耐盐碱植物根际土中分离得到3株耐盐碱解磷能力较强的菌株，将解磷菌株施入到轻度盐碱土与沙子混合的缺磷土壤中，验证其在盐碱条件下解磷效果。绿豆生长过程中补充缺磷营养液，结果发现施用解磷菌后可以保证绿豆的正常生长，说明解磷菌具有解磷效果，可以分解盐碱土壤中被固定的磷供绿豆生长需要。施用解磷菌的的绿豆长势明显好于使用营养液不缺磷的对照，说明解磷菌不仅具有解磷功能而且还有促生功能。程宝森等[34]从葡萄根际土壤中分离得到29株解磷细菌，通过盆栽试验分析，表明接种解磷细菌处理的赤霞珠扦插苗株高、地下干质量和地上干质量显著高于对照。而本研究在盐碱环境下种植绿豆，发现施菌处理后对绿豆有一定的促生效果，能够缓解盐碱胁迫对绿豆生长带来的抑制 作用。

盐碱胁迫下植物细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)大量积累，同时使膜脂和核酸受到氧化损害[35]，抑制植物生长。为了抵御盐碱胁迫的伤害，植物自身拥有一套完整的抗氧化防御系统，用来保护植物本身不受损伤[36]。本研究在接种耐盐碱高效解磷菌株后，绿豆叶片中抗氧化酶活性均降低，说明施入的解磷菌株不仅将土壤中难溶性磷分解为可供绿豆吸收利用的磷，同时还改善了绿豆的生长环境，降低了盐碱胁迫对绿豆的伤害。Sarkar等[37]和Upadhyay等[38]的研究中发现，筛选得到的促生菌株接种于植物后，植物抗氧化酶活性也有所降低，其中Sarkar等[37]分离得到的菌株耐4 mol/L的NaCl，Upadhyay等[38]分离得到的菌株耐 8 mol/L的NaCl，而本研究中分离得到的解磷菌2株耐9 mol/L的NaCl，1株耐11 mol/L的NaCl，同时能在pH为11的培养基中生长，说明我们分离得到的菌株耐盐碱能力更强。

MDA含量的变化反映细胞质膜的损伤情况，数值越大代表膜的过氧化程度越严重[39]，而且MDA含量的降低一般与脯氨酸含量的升高有关[40]；植物体内脯氨酸含量的高低通常可以作为判断植株盐碱抗性强弱的重要指标之一[41]，它能够维持亚细胞结构的稳定，清除自由基，还能缓解植物细胞因胁迫受到的损伤。本研究发现接种解磷菌株后绿豆幼苗体内的丙二醛含量降低，说明绿豆幼苗受到的氧化损伤程度较轻；接种解磷菌株后绿豆幼苗叶片中脯氨酸的含量较未接种对照相比显著增加，而MDA的含量显著降低，说明二者之间存在一定的相关性。Islam等[42]和Yasin等[43]的研究中发现筛选得到的多株促生菌具有溶磷及产植物激素IAA等促生特性，将菌株接种于植物后，脯氨酸含量明显增加，说明在接种促生菌株后，植株的盐碱抗性也随之增强。同样本研究中，接种解磷菌株后，绿豆叶片中脯氨酸含量与未接种对照相比显著增加，与前人研究结果相似。

土壤酶是土壤生态系统中不可或缺的一部分，土壤中酶活性与微生物的关系十分紧密，常常被用作表征土壤中微生物群落活动情况，但是盐碱胁迫能够显著影响土壤酶活性和功能，降低土壤酶的分泌量，对土壤环境造成破坏。相关研究表明，土壤酶活性与土壤中微生物数量有关，当土壤中微生物数量改变时，土壤酶活性也会随之发生改变[44]。本研究接种耐盐碱高效解磷菌后，与未接种对照相比，处理组土壤中的磷酸酶以及过氧化氢酶活性显著上升，说明施入解磷菌株以后，土壤中的难溶性磷或不溶性磷被解磷菌株转化为可供植物直接利用的形态，使盐碱土壤中磷的利用效率提高；过氧化氢酶活性上升，说明微生物活动增加，土壤总的生物学活性上升。在本研究中分离得到的解磷菌株较前人研究相比具有更高的解有机磷量，并且具有较强的耐盐碱的能力，促生效果较好。

4 结 论

本研究从耐盐碱植物羊草和碱蓬根际土中共分离得到100株不同的解磷菌，通过测定菌株的解磷圈和解磷量，最终选出3株高效解有机磷菌，这3株菌株具有多种促生功能，通过生理生化和分子鉴定，这3株菌分别为Pseudomonassp.，Acinetobactersp.和Microbacteriumsp.；对3株菌株进行耐盐碱能力的测定，结果发现三株菌株均具有较强的耐盐碱能力；在轻度盐碱缺磷土壤中分别接种3株菌，3株菌均表现出较好的解磷和促生能力，增强了土壤酶的活性，减缓了盐碱胁迫对绿豆生长的抑制。