不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗生理特性和硒吸收的影响

黄科文，李克强，岁立云，刘 继，刘 磊，王 铤，郑阳霞，林立金，廖明安

(1. 四川农业大学 园艺学院，成都 611130； 2. 成都市农林科学院，成都 611130；3. 四川农业大学 果蔬研究所，成都 611130)

硒(Selenium，Se)是动植物不可或缺的必需元素[1]，增强经济作物对土壤硒的富集能力既能促进硒在生物圈的循环，还能提高食物链中的硒含量，进而降低人体硒摄入不足的风险。目前，土壤施硒或喷施硒肥是提高经济作物硒含量的主要措施，尽管在果树、蔬菜、茶叶及农作物等产业中取得了突出成果[2]，但Thiry等[3]指出大部分植物均为非聚硒类植物，不仅对硒的富集能力有限，在较高浓度的硒处理下还会出现植株徒长，蛋白质降解，叶片萎缩等症状，无法正常生长[4-5]。因此，借助适宜的农业措施或栽培技术来提高经济作物的抗逆性和富硒能力具有十分重要的现实意义。嫁接是将砧木与接穗相互拼接，使其切口的相邻细胞分化形成同型组织，进而共同发育成完整植株的无性繁殖手段，被广泛应用于园艺植物的栽培及繁育中[6-7]。嫁接不仅可以保持母本的优良性状，还在增强植株的抗病[8]、抗旱[9]、耐盐[10]和耐热[11]等方面发挥着重要作用。研究表明，砧穗的接口在经历了愈伤组织发生、胞间连丝形成、形成层的分化与连接、木质部及维管束连接之后，砧木与接穗通过木质部与韧皮部开始进行水分、营养以及信号物质的运输与传递[12]。长久以来，传统的理论认为不同砧木对土壤中矿质元素吸收特性的差异是影响接穗营养物质含量的关键因素[13-14]。王晓芳等[15]认为，造成葡萄不同砧穗组合N、P、K水平差异的主要原因是不同砧木的根系在形态及结构上存在显著差异，进而影响了接穗对大量元素的吸收和转运。曹耀鹏等[16]的观点与其相似，认为土壤中营养元素的垂直分布及砧木根系的形态特征是导致植株对土壤元素的吸收表现出时效性差异的主要因素。但随着分子生物学的快速发展，人们发现砧木与接穗之间存在着蛋白质及RNA等遗传物质的长距离运输，为揭示嫁接对植株遗传性状的影响开启了新的篇章[17-18]。此外，利用不同种类的植株嫁接还可能影响甲基转移酶的表达，导致砧木与接穗的表观遗传发生一定频率的变化[19]。林立金[20]以不同长势的少花龙葵为嫁接材料，发现即便是自根嫁接也能提高植株的DNA甲基化水平，并稳定地遗传到F1代。这些研究证明，在嫁接条件下砧木与接穗之间发生着复杂的砧穗互作效应，而这种互作效应是否可以影响植株对硒的吸收和转运？又能否随着嫁接次数的增加产生叠加效应？以上问题的揭示不仅可以为嫁接技术的理论研究提供新的思路，还对增强植物富硒能力的繁育方法具有指导意义。扦插是利用植物的细胞全能性，使其离体器官在适宜的环境条件下再生成完整植株的繁殖技术，具有完整继承亲本遗传物质，保持品种优良特性等优点[21]。以接穗的茎段扦插繁殖既能保持亲本的遗传性状又能通过不定根吸收土壤养分，可以有效避免砧木异源根的影响，客观真实地反映砧穗互作效应对植株生长发育的影响。

豆瓣菜(Nasturtiumofficinale)为十字花科豆瓣菜属水生草本植物，具有分布广、长势旺及扦插成活率高等优点，因其口感脆嫩，营养丰富，常用作绿叶蔬菜食用[22]。研究表明豆瓣菜是一种次生富硒植物，对外源硒的耐受范围广，富集能力强，当土壤硒含量达到10 mg/kg时，既能显著提高豆瓣菜各部位硒含量，还能有效促进其生长[23]。笔者前期研究了不同砧穗组合对豆瓣菜扦插苗硒积累的影响，发现以西兰花(十字花科)为砧木嫁接豆瓣菜后扦插对豆瓣菜扦插苗的生长及抗逆性均有显著的促进作用。鉴于此，本试验在土壤硒含量为10 mg/kg条件下，以西兰花为砧木，研究不同次数嫁接后扦插对豆瓣菜生长及富硒特性的影响，以期进一步促进豆瓣菜对硒的积累并为揭示砧穗互作效应的生理机制提供 参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试豆瓣菜嫩枝取自四川农业大学成都校区周围农田，西兰花为早熟耐热品种‘绿洲西兰花’。

供试土壤为水稻土，取自四川农业大学成都校区周围农田(30°71′N，103°86′E)，本底值为pH 7.42，有机质31.73 g/kg，全氮1.05 g/kg，全磷0.37 g/kg，全钾25.71 g/kg，碱解氮56.13 mg/kg，速效磷17.15 mg/kg，速效钾56.65 mg/kg，全硒0.35 mg/kg。将土壤风干、碾碎，称取4.0 kg装于21 cm×20 cm(高×直径)的塑料盆内，加入分析纯Na2SeO3溶液，使土壤硒含量为10 mg/kg，保持土壤田间持水量的80%，自然放置平衡4周，期间不定期翻土混合，使土壤充分混合均匀。

1.2 试验方法

2017年9月，在四川农业大学成都校区避雨棚内将豆瓣菜嫩枝扦插于持淹水状态的土壤(未添加硒)中繁育，扦插深度为土壤以下2 cm，栽培期间及时浇水并预防病虫害，每2周浇灌1次 N∶P∶K=15∶15∶15(体积比)的复合肥水溶液。西兰花种子于2017年9-12月每2周进行1次穴盘育苗以确保每次嫁接均有长势一致的砧木，待幼苗茎高约8～9 cm，5～6片真叶展开时移栽至21 cm×20 cm(高×直径)的塑料盆内中栽培(未添加硒土壤)，适应1周后进行嫁接处理。

嫁接处理分3个阶段，第1阶段：将西兰花幼苗从离地约4 cm处剪断，保留砧木3片真片，取2 cm长的豆瓣菜茎尖为接穗进行嫁接处理。嫁接采用劈接法，接口处用1 cm宽的嫁接带捆绑固定，并用透明塑料袋罩住整株植株防风保湿，待嫁接苗成活后去掉嫁接带及塑料袋。第2阶段：在第1阶段嫁接苗成活30 d后，分别以未嫁接及一次嫁接的豆瓣菜茎尖为接穗，新培育出的西兰花幼苗为砧木进行嫁接处理，方法同上。第3阶段：在第2阶段嫁接苗成活30 d后，分别以未嫁接、一次嫁接、二次嫁接的豆瓣菜茎尖为接穗，新培育出的西兰花幼苗为砧木进行嫁接处理，方法同上。

扦插试验于2018年1月在温度为25 ℃，光照度为4 000 lx的温室内进行。待第3阶段嫁接苗成活30 d后，取未嫁接(对照)、一次嫁接、二次嫁接、三次嫁接的长势一致，长约5 cm的豆瓣菜嫩枝扦插于准备好的硒处理土壤中，每盆扦插3株，每个处理重复6次。栽培期间及时浇水保持土壤持淹水状态，不定期更换盆与盆的位置以减弱边际效应的影响，及时去除杂草并防治病虫害，60 d后收获材料。

1.3 样品收集与测定分析

2018年3月，收集豆瓣菜自上往下第3～4片功能叶，采用乙醇-丙酮提取法[24]测量豆瓣菜叶片的叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量，剩余叶片经磷酸缓冲液研磨、离心、提取后分别采用氮蓝四唑法[25]、愈创木酚法[25]、高锰酸钾滴定法[25]以及考马斯亮蓝染色法[25]测量豆瓣菜叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及可溶性蛋白含量。之后整株收获豆瓣菜并分装成根、茎、叶，经自来水冲洗干净后用去离子水润洗3次，在110 ℃杀青15 min，80 ℃条件下烘干至衡量，分别用电子天平称量。烘干样品经粉碎，过筛后分别采用蒽酮比色法[25]及氢化物原子荧光光谱法[24]测定豆瓣菜根、茎、叶的可溶性糖及硒含量。

1.4 数据处理

数据采用DPS进行方差分析(Duncan’s新复极差法进行多重比较)，转运系数=植物地上部分硒含量/根系硒含量，硒积累量=植物硒含量×植物生物量。

2 结果与分析

2.1 不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗生物量的影响

由表1可知，以西兰花为砧木进行不同次数嫁接后，豆瓣菜扦插苗各部位的生物量均随着嫁接次数的增加呈上升趋势，说明多次嫁接对豆瓣菜扦插苗干物质的积累具有一定积累效应。在所有嫁接处理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、茎秆、叶片以及地上部分的生物量均显著高于其他处理，分别较对照提高266.84%、256.49%、 174.03%、211.01%。另外，二次嫁接使豆瓣菜扦插苗各部位的生物量较一次嫁接提高99.87%～ 209.39%，而与二次嫁接相比，三次嫁接则使其生物量提高11.27%～16.35%。对豆瓣菜扦插苗的根冠比而言，二次嫁接和三次嫁接显著提高豆瓣菜扦插苗的根冠比，而一次嫁接则使其显著低于对照，这可能与豆瓣菜扦插苗的可溶性糖含量在不同次数嫁接处理下存在差异有关，将在讨论部分详细论述。

2.2 不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗光合色素含量的影响

由表2可知，与生物量结果相似，豆瓣菜扦插苗的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量均随着嫁接次数的增加呈上升趋势，并在三次嫁接处理下达到最大值，较对照提高43.49%～ 65.82%。与对照相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接使豆瓣菜扦插苗总叶绿素的含量分别较对照提高了28.96%、48.93%和59.48%，类胡萝卜素含量分别较对照提高 21.11%、37.62%和 43.49%。二次嫁接使豆瓣菜扦插苗的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别较一次嫁接提高14.91%、17.41%、13.63%，而与二次嫁接相比，三次嫁接则分别使其提高6.56%、8.80%和 4.27%。与叶绿素含量的趋势相反，豆瓣菜扦插苗的叶绿素a/b随着嫁接次数的增加表现出下降的趋势，这有利于豆瓣菜在弱光环境(温室)下对光能的利用，增强叶片的净光合速率。

表1 不同次数嫁接处理下豆瓣菜扦插苗生物量Table 1 Biomass of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

注：数据为“平均值±标准差”，同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:The data are “mean ± standard deviation”, and the different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同次数嫁接处理下豆瓣菜扦插苗光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.3 不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由表3可知，豆瓣菜扦插苗的SOD活性和POD活性随着嫁接次数的增加均表现出下降的趋势，并在三次嫁接处理下达到最小，分别较对照降低20.87%和32.73%。就豆瓣菜扦插苗的CAT而言，随着嫁接次数的增加豆瓣菜扦插苗的CAT活性表现出持续上升的趋势，并在三次嫁接处理下达到最大值，较对照提高54.92%。另外，豆瓣菜扦插苗的MDA含量随嫁接次数的增加表现出下降的趋势，一次嫁接、二次嫁接和三次嫁接分别使其MDA含量较对照降低了14.50%、 38.62%、43.05%。这表明嫁接增强了豆瓣菜扦插苗对氧化胁迫的抗逆性，且这种促进作用随嫁接次数的增加得到进一步加强。

表3 不同次数嫁接处理下豆瓣菜扦插苗抗氧化酶活性和MDA含量Table 3 Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.4 不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗可溶性糖含量的影响

由表4可知，对豆瓣菜扦插苗的可溶性糖而言，与对照相比，一次嫁接不同程度地降低了豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量，而二、三次嫁接使其显著高于对照。在所有处理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、根茎、叶片以及地上部分的可溶性糖含量均显著高于其他处理，并分别较对照提高81.33%、71.28%、42.02%和 81.36%。另外，随着嫁接次数的增加，豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量表现出上升趋势，说明多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗可溶性糖的积累，在降低豆瓣菜细胞水势，增强植株抗逆性中发挥着重要的生物学作用。

表4 不同次数嫁接处理下豆瓣菜扦插苗可溶性糖含量Table 4 Soluble sugar content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting g/g

2.5 不同次数嫁接对豆瓣菜扦插苗硒含量的 影响

由表5可知，与对照相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接均显著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，分别较对照提高7.05%、6.84%和 6.47%。而豆瓣菜扦插苗茎秆、叶片以及地上部分的硒含量均随着嫁接次数的增加呈下降趋势，其中三次嫁接使豆瓣菜扦插苗茎秆、叶片以及地上部分的硒含量均达到最低，分别较对照降低40.07%、24.22%和32.50%。另外，不同次数嫁接处理均显著降低了豆瓣菜扦插苗的硒转运系数，并随着嫁接次数的增加表现出下降的趋势。

表5 不同次数嫁接处理下豆瓣菜扦插苗硒含量Table 5 Selenium content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.6 不同次数嫁接对单株豆瓣菜硒积累量的影响

由表6可知，豆瓣菜扦插苗不同部位的硒积累量均随着嫁接次数的增加呈上升趋势，其中二次嫁接及三次嫁接使其根系、根茎、叶片以及地上部分的硒积累量均显著高于对照，而与对照相比，一次嫁接对豆瓣菜扦插苗硒积累量的影响不显著。在所有处理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、茎秆、叶片以及地上部分的硒积累量均达到最大，分别较对照提高290.44%、113.92%、 107.94%和110.08%。

表6 不同次数嫁接处理下单株豆瓣菜扦插苗硒积累量Table 6 Selenium accumulation of single N.officinale cutting under different numbers of grafting μg

3 讨 论

嫁接能够影响植株的多种农艺性状，选择适宜的砧穗组合嫁接是增强作物抗逆性，改善果实品质，提高经济产量的重要途经之一。在本研究中，以西兰花为砧木嫁接对豆瓣菜扦插苗的生长及抗逆性存在不同程度的影响。随着嫁接次数的增加，豆瓣菜扦插苗各部位的生物量和光合色素含量均表现出上升的趋势，这暗示多次嫁接对豆瓣菜扦插苗部分性状的影响可能存在叠加效应，与管雪松等[26]的研究结果相似。对豆瓣菜扦插苗的生物量而言，二次嫁接使豆瓣菜扦插苗各部位的生物量较一次嫁接提高99.87%～ 209.39%；而与二次嫁接相比，三次嫁接则使其生物量提高11.27%～16.35%。说明多次嫁接虽然对豆瓣菜扦插苗生长的促进效果具有叠加作用，但这种效应随着嫁接次数的增加呈下降的趋势，与嫁接对豆瓣菜扦插苗光合色素含量的影响相似。光合色素是植物光合作用的重要基础，其含量与植物的光合作用效率呈显著正相关，而在弱光条件下，由于叶绿素b具有更强的短波利用率，导致植株叶绿素a/b值越低对光能的利用率越高[27]。本研究结果表明，随着嫁接次数的增加，豆瓣菜扦插苗的光合色素含量及叶绿素a/b分别呈上升及下降的趋势，有利于豆瓣菜扦插苗在弱光条件下(温室)的光合作用，可能是嫁接促进豆瓣菜扦插苗干物质积累的重要原因之一。对豆瓣菜扦插苗的根冠比而言，二、三次嫁接显著提高了豆瓣菜扦插苗的根冠比，而一次嫁接则使其显著低于对照，这也许与豆瓣菜扦插苗的可溶性糖含量在不同次数嫁接处理下存在差异有关。可溶性糖不仅是同化产物及能量的贮藏形式，在调控植物细胞渗透式，同化物分配以及信号转导中均发挥着重要作用[28]。本研究表明，一次嫁接不同程度降低豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量，而二、三次嫁接对其则表现出显著的提升作用。出现这样的结果可能是因为多次嫁接提高豆瓣菜对嫁接胁迫的适应性，加速愈伤组织的发育和形成，使砧穗间营养物质的运输提前恢复正常，进而延长嫁接苗可溶性糖的积累时间[29]。一般而言，在干旱胁迫下植物可以通过可溶性糖的积累来增强植株的持水量[30]，而在土壤水分充足的条件下，可溶性糖的积累具有提高细胞渗透式，增强豆瓣菜需水量的作用，进而诱导了其根冠比的升高来促进根系对水分的吸收。

植物对硒的吸收及转运主要由土壤硒的形态和植物自身的遗传背景共同决定[34]。本试验以西兰花为砧木对豆瓣菜进行不同次数的嫁接后扦插发现，不同次数嫁接对豆瓣菜硒的分布与积累存在着明显差异。与未嫁接的豆瓣菜扦插苗相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接均显著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，而其茎秆、叶片、地上部分的硒含量以及转运系数均随着嫁接次数的增加呈下降趋势，并在二次嫁接及三次嫁接的处理下显著低于对照。这表明在硒处理土壤中，嫁接虽然有利于豆瓣菜扦插苗根系对土壤硒的吸收，但也显著抑制了豆瓣菜将硒从根系转运到地上部分的能力，并且这种抑制作用随嫁接次数的增加表现出叠加效应。出现这样的结果，可能与不同次数的嫁接处理对豆瓣菜扦插苗相关转运蛋白的活性及其硒代谢途径具有不同程度的影响有关[35-36]，尚需进一步深入研究。植物的硒积累量反映其对土壤硒的富集能力，与其长势以及对硒的吸收能力密切相关。在本试验中，随着嫁接次数的增加，豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的硒积累量均表现出上升的趋势，并在二次嫁接及三次嫁接的处理下显著高于对照，这主要归功于嫁接有效促进豆瓣菜扦插苗干物质的积累，有利于豆瓣菜扦插苗对土壤硒的积累。

综上所述，在硒含量为10 mg/kg的土壤中，通过嫁接处理可以在显著提高豆瓣菜扦插苗生物量及光和色素含量的同时有效降低其MDA含量，并随着嫁接次数的增加表现出一定积累效应。随着嫁接次数的增加，豆瓣菜扦插苗的SOD及POD活性均呈先上升后下降的趋势，而CAT的活性则持续上升。此外，多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗根系、茎秆以及叶片中可溶性糖的积累，可能与多次嫁接加快了愈伤组织的形成有关，尚需进一步深入研究。对豆瓣菜扦插苗的硒吸收而言，虽然嫁接显著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，但其地上部分的硒含量及转运系数均随嫁接次数的增加呈下降趋势，在一定程度上抑制了硒向地上部分的转移。尽管如此，由于嫁接对豆瓣菜扦插苗各部位的生物量具有显著的促进作用，从而使豆瓣菜扦插苗各部位的硒积累量在不同次数嫁接的处理下显著高于对照，并随嫁接次数的增加呈上升趋势，表明多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗的生长和对硒的积累。