低渗溶液促进小麦种子萌发的生理机制

冯 岳，魏永胜，冯 浩

(1.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100；2.中国科学院 植物研究所光生物学重点实验室 100093；3.中国科学院大学 生命科学学院，北京 100049；4.西北农林科技大学 国家节水灌溉杨凌技术研究中心，陕西杨凌 712100)

种子引发(Seed priming)是一种基于种子萌发的生物学技术手段[1]，由Heydecker于1973年最早提出[2]，经由特定预处理方法使种子缓慢吸水，确保种子萌发的代谢活动顺利进行，进而提升种子活力，其目标是提高种子的萌发率，并且能增加萌发稳定率和萌发整齐度，进而增加苗的抗性并改良营养状况。近年来，种子引发相关技术对植物的大量研究成果已在农业贸易生产上取得成功运用[3-4]。

常见的引发方法有水引发[5-6]，无机盐引发如KCl和CaCl2[7]，有机物引发如PEG 6000[8]，甚至是纳米材料如纳米银(Silver nanopaticale，AgNPs)[9]等，引发技术现已应用于小麦[7,10]、玉米[3]、水稻[8,11]、番茄[12]、豆类[13]及烟草[14]等作物。如，水引发处理水稻种子可以使萌发时间缩短26.8 h，苗高增加为对照的1.2倍，干质量增加至对照的1.3倍[11]。尽管引发作为一项农业生产技术已经被广泛使用，但机理研究并不深入。一般认为水引发或适度的渗透溶液引发可使种子通过了类似的“逆境锻炼”[15]，给予种子更充分的机会修复细胞膜，提高种子的淀粉酶活力[9]，促进种子代谢，提高种子的保护酶活性[8]，促进DNA修复[16]，增加水孔蛋白表达[17]等。但上述研究未能解释为什么适度的渗透溶液引发的效果优于纯水引发，是否在纯水中引发时吸水过快会造成细胞原生质膜的机械损伤，适度渗透溶液引发处理是促进膜修复还是减轻快速吸水造成的机械损伤等问题。

本研究切入点为确定小麦种子最佳的引发条件，从引发过程中小麦种子物理与生理生化两个方面的变化去揭示引发的机制，以揭示为什么轻微渗透胁迫的引发处理优于纯水或高渗透溶液，进一步揭示引发的机制，为科学利用引发技术提高作物产量、改善品质提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以小麦品种‘小偃22’(TriticumaestivumL.)的陈种子(购于2015年)为材料，以NaCl(分析纯，西安化学试剂厂)为引发剂。选用陈种子作为材料是因为其更能反映引发的效果[18]。经TTC法测定，种子活力为(81.0± 3.35)%。

1.2 试验设计

1.2.1 引发效应的确认 分别以纯水(0 MPa)和水势为-0.1、-0.3、-0.5、-0.7、-0.9、 -1.2 MPa NaCl溶液引发处理小麦种子，以证明引发现象存在并确定最佳的引发条件。小麦种子经75%酒精消毒，置于室温(15.5±2.0)℃下，在相应的NaCl溶液中避光浸泡12 h，取出后拭干水分并避光风干24 h作为引发处理，然后进行萌发试验。萌发试验取引发处理后的种子各50粒，置于铺有2层滤纸的9 cm培养皿中，加无菌水5 mL，在(20.5±2.0)℃恒温培养箱(KRC-100CL，上海齐欣科学仪器公司)中避光培养，每24 h补充无菌水5 mL并统计发芽粒数，以胚根突破种皮，长度为0.5 cm时为萌发，发芽种子移出培养皿。连续7 d无种子萌发时终止萌发试验。每个处理5次重复(共250粒)。以经过活力调整的萌发率为萌发指标：G=Ng/(Nt·Vi)×100%

式中：G为萌发率(%)；Ng为试验期内累计萌发种子数；Nt为每个培养皿中供试种子数；Vi为TTC法测定的小麦种子活力。

1.2.2 NaCl引发的生理机制 (1)建立吸水曲线：取未经引发的干种子、经纯水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引发处理的种子分别放入5个培养皿中，加5 mL纯水(每皿50粒，每个处理5个重复共250)，置于(20.5±2.0)℃培养箱中培养，分别在0、6、12、24、36、48、72和96 h称量，记录质量，称量前拭干水分，称量后放回培养皿。以相对质量(吸水后质量÷吸水前的初始质量)对吸水时间作图。

(2)生理指标测定：种子细胞膜相对透性、MDA质量摩尔浓度、可溶性蛋白、α-淀粉酶活性及总淀粉酶活性等生理指标测定参考高俊凤[19]主编的《植物生理学实验指导》。以未经引发的种子作为对照，以0、-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液引发的种子(风干24 h后)为处理测定相关生理指标。测定设5个重复，每个重复25粒。

(3)对比KCl引发：将经纯水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引发处理的种子与经 -0.3及-0.7 MPa KCl溶液引发处理的种子分别放入5个培养皿中(每皿50粒，每个处理5个重复共250)，加5 mL纯水，置于(20.5±2.0)℃培养箱中培养，每24 h补充无菌水5 mL并统计发芽粒数，记录萌发进程，以初步探究K+、Na+对引发产生的不同效应。

1.3 数据处理

利用Excel对数据分析并作图，并利用Chapman 3-parameter模型对萌发曲线进行拟合，计算萌发率达到50%所需要的时间 t50，以及萌发率达到5%所需要时间 t5 (因为试验每个重复为50粒，故以有2粒以上种子萌发时刻作为萌发的启动时间)。利用R软件进行统计分析，进行差异显著性检验。文中数据以“平均值±标准误”表示，插图中的误差棒均为标准误。

2 结果与分析

2.1 低浓度NaCl引发处理下小麦种子萌发情况

不同水势的NaCl溶液引发处理对小麦种子萌发率的影响有显著差异(图1)。最终萌发率(吸水192 h)在-0.3 MPa处理下最高，为 (89.2±3.9)%，0～-0.3 MPa之间随着水势下降而升高，而-0.3～-1.2 MPa则随水势降低而降低，在-0.7 MPa萌发率开始低于50%。因此，后续试验中以纯水，-0.3 MPa(最佳)和 -0.7 MPa(<50%)的NaCl溶液引发处理种子进行研究，以未引发的干种子为对照(CK)。

从萌发的进程看，纯水引发处理的种子萌发启动时间(萌发率5%)较-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液处理的种子分别早2.47和22.67 h，萌发率达到50%所需时间比-0.3 MPa NaCl溶液处理早4.05 h，但萌发率在120 h后开始低于 -0.3 MPa引发处理的种子直至试验结束。而 -0.7 MPa NaCl溶液引发处理的种子最终萌发率低于50%，且萌发启动迟缓。

2.2 NaCl引发处理对小麦种子吸水过程的影响

试验中种子吸水过程依据吸水速率可分为快、慢、快3个时期，第一个时期为0～24 h，吸水曲线平均斜率为(1.62±0.28)×10-2(表1)；第二个时期为24～72 h，斜率为(0.76±0.11) ×10-2；第三个时期为72～96 h，斜率为(1.21± 0.02) ×10-2。在吸水初期(0～24 h)，与未经引发处理的种子相比，无论是纯水还是-0.3和 -0.7 MPa NaCl溶液引发处理，其吸水速率均较低(图2)。但24和48 h后，纯水和-0.3 MPa引发处理的种子吸水速率先后超过未引发的种子，而-0.7 MPa NaCl溶液引发处理的种子吸水速率全程处于最低水平。与纯水引发相比，-0.3 MPa引发处理的种子吸水初期吸水速率较低，但24 h后二者相近，但吸水量后者始终低于前者。经纯水、-0.3和-0.7 MPa引发处的种子到达相对质量150%所用时间分别为23.6、37.6和53.8 h。

实线为不同水势溶液中种子萌发过程的拟合曲线，不同的点为实测值

Solid line in the figure is the fitting curve of seed germination process in different water potential solutions.The different points are measured values

图1 低浓度NaCl引发处理小麦种子的萌发率
Fig.1 Promotion of wheat seed germination under treatment of hypoosmotic NaCl priming

表1 不同引发条件小麦种子吸水速率(斜率)变化Table 1 Changes in water absorption (slope ) of wheat seeds during different germination periods under different priming conditions

注：数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05).Duncan’s法多重比较。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference in table(P<0.05).Duncan’s method multiple comparison.The same below.

虚线表示相对质量为150%

Dotted line indicates relative mass of 150%

图2 不同引发处理的小麦种子吸水过程
Fig.2 Water absorption process of wheat seeds under different priming treatments

2.3 适度NaCl引发处理对小麦种子膜完整性的影响

经-0.3 MPa NaCl溶液处理的种子其MDA质量摩尔浓度(图3-A)和相对电导率(图3-B)均显著低于其他处理，而经-0.7 MPa 处理的种子其MDA质量摩尔浓度与未经处理和纯水引发的种子差异不显著，但相对电导率显增加，表明纯水对萌发中的种子的伤害可能更多地来源于机械损伤，如膜撕裂，而不是化学因素造成的伤害。同理，与-0.3 MPa NaCl溶液处理相比，未引发种子和纯水引发后的种子中MDA质量摩尔浓度和相对电导率均上升，且未引发种子的细胞膜相对透性显著高于-0.3 MPa NaCl溶液处理，同样表明种子在纯水中萌发会伤害细胞膜，且主要是机械伤害。

2.4 NaCl引发处理对小麦种子可溶性蛋白质量分数的影响

与未经引发的种子相比，经过引发后的种子其可溶性蛋白质量分数显著增加(图3-C)。经 -0.3 MPa NaCl溶液处理后其可溶性蛋白质量分数显著高于未经引发的种子和纯水引发的种子，高于-0.7 MPa处理，但差异不显著。但同样处理的种子由另一独立小组测定的结果与本试验中结果有相同变化趋势(结果未公开)，因此，-0.3 MPa NaCl溶液处理后可溶性蛋白质量分数高于-0.7 MPa处理的结果也是肯定的。分析萌发数据，可以推定这些增加的可溶性蛋白更多的是与萌发相关的功能性蛋白，而不是类似于 -0.7 MPa处理后胁迫蛋白。究竟是哪些相关蛋白增加，有待于通过蛋白组学研究来揭示。

图中柱上不同小写字母表示处理间差异达5%显著水平

Different lower-case letters indicate statistically significant difference under different treatments (P<0.05)

图3 不同引发条件下小麦种子的丙二醛质量摩尔浓度(A)、相对电导率(B)、可溶性蛋白质量分数(C)
Fig.3 Malondialdehyde molality，relative electrical conductivity and soluble protein fraction in wheat seeds under different priming conditions

2.5 NaCl引发处理对小麦种子淀粉酶活力的影响

萌发过程中，种子中的α-淀粉酶活性(图4-A)和总淀粉酶活性(α-淀粉酶和β-淀粉酶活性之和)(图4-B)均随萌发时间的延续而增加。萌发率与同期α-淀粉酶和总淀粉酶活性的相关性分别为0.73和0.74，而与前24 h α-淀粉酶和总淀粉酶活性的相关性分别为0.75和0.77。表明萌发率与淀粉酶活性相关，但更多地受萌发前的淀粉酶活性影响，尤其是β-淀粉酶活性。成对t检验结果(表2)显示，纯水引发与未经引发种子的α-淀粉酶活性差异不显著，但总淀粉酶活性的差异达到极显著水平。表明纯水引发主要是提高了β-淀粉酶活性，而非α-淀粉酶活性。-0.3 MPa引发处理的种子的α-淀粉酶显著高于其他处理，但总淀粉酶活性与纯水处理间无差异。表明适当盐胁迫处理可以提高α-淀粉酶活性，促进萌发。而-0.7 MPa引发处理的种子的α-淀粉酶和总淀粉酶活性均较低，这可能是萌发率低的原因之一。

图4 引发后的小麦种子的淀粉酶活性在萌发过程中淀粉酶活性的变化Fig.4 Amylase activity of wheat seeds during germination of seeds after different priming conditions

2.6 NaCl和KCl分别引发处理对小麦种子萌发进程的影响

为进一步确认-0.3 MPa NaCl溶液处理可提高小麦种子萌发率的原因，对同为-0.3 MPa 的NaCl和KCl溶液的引发效果进行比较，结果(图5)显示，2种盐溶液都在-0.3 MPa引发处理下最终萌发率最高，但是从整个萌发过程来看，-0.3 MPa KCl引发处理的种子在萌发初期即表现出相对较好的萌发活力，且最高萌发率大于纯水处理，而-0.3 MPa NaCl引发处理的种子是在中后期萌发率超过纯水处理，达到最高萌发率相对较晚。这表明引发处理不仅是水势降低的效果(渗透胁迫)，也会受引发剂性质的影响，本试验中K+效果会优于Na+。

表2 不同引发处理对淀粉酶活性影响的显著性对比Table 2 Significant comparison of effects of different priming treatments on amylase activity

注：**：差异极显著(P≤0.01)，*：差异显著(0.01

Note：**:Extremely significant(P≤0.01), *:Significant(0.01

图5 NaCl和KCl分别引发处理的小麦种子萌发进程Fig.5 Germination processes of wheat seeds primed by NaCl and KCl

3 讨 论

本研究中，经不同水势NaCl溶液处理后的小麦种子最终萌发率存在显著差异，适度的低水势溶液(-0.3 MPa)处理的种子萌发率最高，确认了引发现象的存在。但与纯水处理的种子相比，萌发启动晚(图1)。其他研究也表明这种适度的低水势溶液处理种子萌发率高，而且后期出苗整齐，抗性增强[9,20]，这也正是种子引发技术在生产中得到广泛应用的原因。但适度的低水势溶液(-0.3 MPa)处理的种子萌发启动晚，但后期萌发速率快的现象未见报道。

引发处理可以改善种子的吸水量进而影响种子的萌发率[21]，干种子内部衬质势较高，吸胀速率过快，可能会对细胞膜产生伤害[6]，引发处理被认为可以缓解这种损伤，并有利于膜系统修复[22]。细胞膜脂质过氧化可导致MDA质量摩尔浓度的上升，并进一步伤害膜[23]，若膜损伤以机械撕裂为主，则透性增加会更为突出。本试验结果显示，与未经引发处理的种子相比，纯水和 -0.3 MPa NaCl溶液引发处理的种子吸水速率在24和48 h后分别超过未经引发处理的种子，这可能与吸水初期较慢的吸水速率使得使膜受到较少伤害或得到一定修复，并增加水孔蛋白表达有关。由于纯水和-0.3 MPa NaCl溶液引发的种子中MDA质量摩尔浓度(图3-A)和细胞膜相对透性(图3-B)均低于未经引发处理的种子。纯水引发与-0.3 MPa NaCl溶液引发相比，后者吸水速率(表1)和吸水量均低于前者(图2)，萌发启动晚(图1)，但最终萌发率最高。表明吸水多并不一定萌发率高。而且纯水引发的种子不仅是细胞膜相对透性增加，且MDA产生量较 -0.3 MPa引发处理后的种子更高，说明-0.3 MPa NaCl溶液引发处理后种子的膜破坏性最小或修复得更好。这与部分学者的研究相吻合，肖雪峰等[24]的研究发现PEG能通过渗透作用有效改善植物细胞膜的渗透势，控制种子萌发时水分的进入，有效降低或消除种子吸水过快的情况，使种子有足够时间完成生物膜的修复。

α-淀粉酶是小麦中淀粉水解的关键酶，直接关系到幼苗的建成[25]。本研究也表明，经过引发后种子中可溶性蛋白增加(图3-C)，淀粉酶活性增强，萌发率与淀粉酶活性相关，但更多地受萌发前(引发后)的淀粉酶活性影响，尤其是β-淀粉酶活性，且-0.3 MPa引发处理可以提高α-淀粉酶活性并间接促进了β-淀粉酶在萌发过程中的生成，进而促进萌发。α-淀粉酶活性的增加，可能会增加更多的可溶性糖，进而增加种子内外水势差，增加吸水速率。但实际结果是-0.3 MPa NaCl引发与纯水引发相比，吸水速率和吸水量均较低。因此，淀粉水解后的糖可能更多地被呼吸利用或转化为其他物质，而不是作为溶质降低水势来增加吸水动力。

钾元素为小麦必需的大量矿质元素，而钠元素仅为有益元素，分别以同样摩尔浓度的NaCl和KCl溶液处理小麦种子，检测对萌发过程的影响，有利于区分Na+和K+的生理效应。尽管有关于不同引发剂效应的研究[22]显示了不同化合物之间引发处理结果上的差异，但以往的研究没有去区别不同离子的效应。本研究结果表明引发处理不仅是水势降低的效果(渗透胁迫)，也会受离子差异的影响，本例中K+效果优于Na+，即使是-0.7 MPa处理下，K+效果也优于Na+，但原因尚不清楚。

综上所述，NaCl适度胁迫引发(-0.3 MPa)和纯水引发均可以提高小麦种子萌发率，未经引发和纯水引发的种子在吸水过程中快速吸水伤害细胞膜，而-0.3 MPa NaCl引发处理则减少了细胞膜所受的伤害，提高淀粉酶，尤其是α-淀粉酶活性促进萌发。这种萌发率的提高，不是通过增加吸水速率或吸水量实现的。未来研究中，应注意引发处理的种子在萌发过程中不同时刻的物质变化。