Bacillus amyloliquefaciens YM6对盐胁迫条件下玉米幼苗生理及生化的影响

王华笑，刘 环，杨国平,2，张 琇,2,3，李 壮，张 炎

(1.北方民族大学 生物科学与工程学院，银川 750021；2.宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点试验室，银川 750021；3.国家民委发酵酿造工程生物技术重点试验室，银川 750021；4. 新疆农业科学院 土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091)

土壤盐渍化是土地退化的一种现象[1]，严重影响畜牧业和农业的发展[2]。土壤盐分积累会影响植物细胞结构及功能[3]，增加活性氧积累[4]，抑制植物光合作用[5]，影响作物产量[6]。

研究发现，逆境胁迫条件下接种植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria-PGPR)可促进植物生长和干物质累积[7-8]，增加植物中具有清除活性氧功能的酶类活性。陈淋[9]研究发现接种解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensSQR9)使盐胁迫中玉米的过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽酶活性显著升高,Kumari等[10]研究发现假单胞菌AK-1 (Pseudomonassp.strain AK-1) 和芽孢杆菌SJ-5 (Bacillussp. strain SJ-5)在盐胁迫条件下可诱导大豆幼苗脂肪氧合酶(LOX)和过氧化物酶(POD)活性增强，Nautiyal等[11]发现解淀粉芽孢杆菌 (BacillusamyloliquefaciensNBRISN13)可诱导盐胁迫下水稻植株内过氧化氢酶活性提高1.5倍，王春娟等[12]研究蜡质芽孢杆菌(BacilluscereusAR156)诱导盐胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性显著提高，另外木霉菌[13]、假单胞菌属[14]、VA菌根真菌[15]等对诱导植物抗氧化酶系活性提升均存在显著作用。

宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室筛选获得一株能在中度盐胁迫(75 mmol/L)条件下促进玉米生长的菌株YM6，经生理生化及16S rRNA序列同源性对比鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌属于PGPR[16]，研究表明解淀粉芽孢杆菌，可改善植物体内氧化及过氧化物浓度[17]，调节植物细胞渗透势减轻逆境胁迫对植物细胞结构损伤；抑制或减轻某些植物病害对植物生长发育产生的不良影响[18]，促进植物生长。本研究以玉米为试验材料，在75 mmol/L NaCl盐胁迫条件下接种解淀粉芽孢杆菌YM6菌株，探究YM6菌株对盐胁迫下玉米根尖细胞超显微形态及玉米植物内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、脯氨酸(Pro)等生理生化指标的影响，探究解淀粉芽孢杆菌提高玉米耐盐能力机理，旨在为研究植物根际促生菌促进植物抗逆性机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 生物材料

试验材料：供试玉米种为‘郑单958’，选择颗粒饱满、无破损、大小一致的玉米种子作为试验 材料。

供试菌株：解淀粉芽孢杆菌YM6(BacillusamyloliquefaciensYM6)，保存于宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室。

1.2 化学试剂

SOD活性测定试剂盒、CAT活性测定试剂盒、POD活性测定试剂盒、H2O2质量分数测定试剂盒、MDA质量分数测定试剂盒、Pro质量分数测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器设备

日本日立H-7650 透射电子显微镜、美国RMC POWERTOME XL超薄切片机、上海佑科UV-1000紫外可见分光光度计。

1.4 植物营养液母液配制

植物营养液(1 000 ×)：母液1：CoCl2·6 H2O 0.002 g、H3BO31.43 g、MnCl2·4 H2O 0.905 g、ZnSO4·7 H2O 0.11 g、CuSO4·5 H2O 0.051 g、Na2MoO4·2 H2O 0.061 g溶于500 mL去离子水；母液2：MgSO4·7 H2O 24.648 g溶于500 mL去离子水；母液3：K2HPO487.09 g、KH2PO468.443 g溶于500 mL去离子水；母液4：CaCl2·2 H2O 55.495 g溶于500 mL去离子水；母液5：FeC6H5O7·3 H2O 2.5 g溶于500 mL去离子水；以上5种母液各取1 mL至800 mL纯水中, 添加3.385 g (NH4)2SO4，然后用纯水定容至1 000 mL，混合均匀，即得植物营养液，1×105Pa灭菌20 min后作为正常的植物营 养液。

1.5 试验方法

1.5.1 玉米种子催芽与培养 选取约200粒大小一致、饱满无损伤的玉米种子，用体积分数为95%酒精浸泡5 s消除种子表面张力,质量分数为0.1% HgCl表面消毒40 s[19]，无菌水冲洗4～7次。将消毒的种子置于铺有湿润无菌纱布的培养皿内，于25 ℃黑暗条件下培养48～72 h，萌发备用。

1.5.2 试验处理 CK0:无盐胁迫、不接种YM6的玉米植株为正常生长的对照。

CK1：将发芽的玉米种植于含有75 mmol/L NaCl的培养瓶中，不接种YM6的玉米植株为盐胁迫对照。

YM6处理：将发芽的玉米种植于含有75 mmol/L NaCl的培养瓶中，接种浓度为1×108cfu/mL的YM6菌株，接种量为每株20 μL，滴加于玉米幼苗根系。

每瓶4株玉米苗，每个处理设置5个重复，所有处理均放置于光照培养箱(25 ℃，16 h光照与18 ℃，8 h黑暗)中培养,照度10 000 lx。

1.5.3 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗根尖细胞形态影响 玉米培养至14 d，待玉米植株生长有明显区别后，切取试验组与对照组玉米根尖相同部位0.5～1.0 cm，做透射电镜预处理：前固定：用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗后置于4 ℃ 体积分数为2% 多聚甲醛—2.5% 戊二醛固定液固定液中3 h，然后更换磷酸盐缓冲液冲洗3次，每隔2 h换洗一次。

后固定：用体积分数为1%锇酸于4 ℃浸泡 1 h后用磷酸缓冲液浸泡2次，每次间隔15 min。

脱水渗透：分别用体积分数为30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精4 ℃脱水5 min,体积分数为75%叔丁醇室温渗透2次，每次5 min,体积分数为100%叔丁醇-20 ℃渗透20 min。

包埋:环氧丙烷渗透2次，每次间隔15 min，后至于35 ℃完全包埋液内6 h，转移至包埋板内42 ℃包埋过夜制得玉米根尖包埋组织。

包埋块切超薄切片(40～50 nm)用于透射电镜观察。

1.5.4 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗生化指标影响 取试验组、CK1、CK0培养至14 d的玉米幼苗，用蒸馏水冲洗5～6次，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗2～3次，无菌滤纸吸干水分，剪取玉米幼苗地上(茎叶)、地下部分(根)置于-20 ℃，真空5 Pa脱水保存，备用，干燥后的玉米植株进行生化指标测定。CAT活性、SOD活性、POD活性、H2O2、MDA、Pro质量分数测定均采用微量法 测定。

1.5.5 数据分析 采用Excel 2003软件对试验数据进行分析并制图；利用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析 (Duncan法,P<0.05)

2 结果与分析

2.1 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗根尖细胞形态的影响

细胞壁与细胞膜作为细胞的保护组织，其稳定性在盐碱胁迫中有关键性作用。如图1所示，盐胁迫作用下A组发生质壁分离现象，原生质体内缩；B组质壁分离现象不明显，原生质体无明显内缩现象,且细胞壁较厚，完整性好。

细胞核是由核被膜、染色质、核仁及核基质构成，是细胞中最明显的一个细胞器结构体。如图2，在A处理中在盐胁迫条件下核仁颜色加深固化，并且部分核仁出现严重变形，染色质也发生变化。B组处理中一个细胞内存在两个细胞核，细胞核处于复制状态；细胞核无固化，结构较为完整，无变形现象，染色质无明显变化，整体形态优于A组。

线粒体为细胞的各种生命活动提供能量，在遭受盐碱胁迫时结构发生明显的变化。在盐碱胁迫条件下，线粒体数目增加，形状变得不规则。如图3-A组在盐胁迫条件下部分线粒体结构不清晰，出现扩张现象，形状与体积明显变大，内峭腔室也出现增大现象，部分线粒体发生破裂变形。B组的线粒体成卵圆形，结构完整性好，无内质网变形现象，内膜折叠清晰，无空腔产生，数量低于A组。

PM.质膜；CW.细胞壁；箭头表示质壁分离状况；A.盐胁迫不接种组玉米根尖显微形态(×20K)，盐浓度75 mmol/L；B.盐胁迫接种YM6菌株后玉米根尖显微形态(×20K)，盐浓度75 mmol/L，下同

PM.Plasma membrane；CW.Cell wall；The arrow indicates the cytoplasmic wall separation；A.Represents salt stress,micro-morphology of the root tip of non-bacterial group (×20K), and the salt concentration of 75 mmol/L；B.Represents the microscopic morphology (×20K) of maize root tip after inoculation with YM6 strain under salt stress, and the salt concentration 75 mmol/L，the same as below

图1 盐胁迫与接种YM6菌株后玉米根尖细胞质壁分离现象(×20K)
Fig.1 Cytoplasmic wall separation of maize root tip under salt stress with or without YM6 strain(×20K)

箭头指示细胞核仁；A.75 mmol/L盐胁迫不接种对照；B.盐胁迫接种YM6菌株处理

Arrows indicate thenucleolus；A.75 mmol/L salt stress control without YM6；B.Treatment of salt stress with YM6

图2 盐胁迫与接种YM6菌株后玉米根尖细胞核仁形态的结构(×20 K)
Fig.2 Nucleolusr morphology of maize root tip cells after salt stress and inoculation with YM6 strain (×20 K)

胞间连丝成网状分布于细胞之间，贯穿细胞，是细胞间物质传递与信息交换的通道，其结构完整性是反映细胞功能完整性的重要标志。图4中A组处理细胞的胞间连丝完整性差，结构不规则，与细胞间贴合连接不紧密，B组的胞间连丝通道明显，与细胞贴合，形态更为完整。

2.2 M6菌株对盐胁迫下玉米幼苗Pro、MDA、H2O2的影响

由图5-A可知在75 mmol/L NaCl盐胁迫条件下玉米植株地上、地下部分均表现为Pro质量分数低于正常无盐胁迫组，地上部分为32.27 μg/g(DW)(DW代表植株干质量，下同)，地下部分为14.19 μg/g(DW)。盐胁迫接种组与盐胁迫不接种组相比，玉米幼苗地上、地下部分Pro质量分数均显著提高(P<0.05)，且地上部分Pro质量分数为正常无盐胁迫组的7.0倍，为盐胁迫不接种组的4.0倍。

由图5-B可知，在75 mmol/L NaCl盐胁迫下接种YM6菌株，地上部分MDA质量摩尔浓度有所降低，最小值为84.7 nmol/g(DW)是盐胁迫不接种组的0.7倍，但接种组与盐胁迫不接种组玉米幼苗地下部分差异不显著。

由图5-C可知，在75mmol/L NaCl盐胁迫下，地上、地下部分H2O2质量摩尔浓度显著高于无盐胁迫组(P<0.05)，接种YM6菌株后地下部分H2O2质量分数是无盐胁迫组1/3，为0.042 μmol/g(DW)，但与无盐胁迫组相比地上部分差异不显著。

箭头指示线粒体；A.75 mmol/L盐胁迫不接种对照；B.盐胁迫接种YM6菌株处理

Arrows indicate mitochondria；A.The 75 mmol/L salt stress without YM6；B.The treatment of salt stress maize with YM6

图3 盐胁迫与接种YM6菌株后玉米根尖线粒体的结构(×20K)
Fig.3 Mitochondrial structure of maize root tip under salt stress and inoculation with YM6 strain (×20K)

头指示胞间连丝；A.75 mmol/L盐胁迫不接种对照；B.盐胁迫接种YM6菌株处理

Arrows indicate plasmodesmata；A.75 mmol/L salt stress control without YM6；B.Maize under treatment of salt stress with YM6

图4 盐胁迫与接种YM6菌株后玉米根尖细胞胞间连丝(×20 K)
Fig.4 Salt stress on intercellular filaments in maize root tip cells after inoculation with YM6 strain (×20 K)

相同的小写字母表示在0.05水平无显著差异，不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同

Same lowercase letters indicate insignificant difference is at 0.05 level, and the different letters indicate significant difference at 0.05 level.The same below

图5 盐胁迫与接种YM6菌株下玉米渗透调节物质质量分数
Fig.5 Changes of osmotic adjustment substance content of maize under salt stressed-maize induced by YM6 strain

2.3 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗POD、CAT、SOD活性的影响

由图6-A可知75 mmol/L NaCl盐胁迫下，接种组地上、地下部分POD活性与不接种组对比酶活性显著提高(P<0.05)，接种YM6菌株后玉米幼苗地上、地下部分POD活性分别为 461.11 U/g(DW)、281.61 U/g(DW)，但酶活性均低于无盐胁迫组。

由图6-B可知在可知75 mmol/L NaCl盐胁迫下，接种YM6菌株后，玉米植株地上、地下部分CAT活性均显著高于盐胁迫不接种组，地上部分CAT活性最大值为271.9 U/g(DW)，与不接种组相比存在显著性差异(P<0.05)，并且与无盐胁迫组含量基本一致。

由图6-C可知在75 mmol/L NaCl盐胁迫下，接种YM6菌株后，玉米植株地上、地下部分SOD活性均显著高于盐胁迫不接种组(P< 0.05)，地上部分SOD活性最大值为282.28 U/g(DW)。

图6 盐胁迫与接种YM6菌株后玉米抗氧化酶活性Fig.6 YM6 strain on the activity of antioxidant enzymes in maize under salt stress

3 讨 论

3.1 YM6菌株对NaCl盐胁迫下玉米根际细胞的保护作用

根系作为最先感知外界胁迫的植物器官，其结构与功能完整对提高植物抗逆性具有重大作用[20]，细胞壁与细胞膜为细胞最外层的保护组织，可保护植物细胞内部器官免受损害，盐胁迫可增加细胞渗透压，造成细胞内离子失衡，细胞内水分外流导致细胞完整性被破坏，从而产生质壁分离现象[21]。玉米作为非盐生植物，受盐胁迫影响根尖细胞发生明显质壁分离现象，原生质体内缩，细胞结构发生改变；细胞核固缩，其完整性遭受破坏，且细胞内线粒体产生空腔，部分发生破损，这与非盐生植物膜质结构及气孔导度密切相关[22]。试验结果发现接种试验组玉米根尖细胞核发生分裂，细胞核一分为二，细胞核固缩程度较盐胁迫不接种组明显减缓，且线粒体结构完整性优于盐胁迫无菌组，接种组可见完整胞间连丝。其机理可能是菌株YM6可调节植物离子平衡，保护细胞核及其他细胞器完整性[16]，从而提高玉米根系应对盐胁迫的能力。

3.2 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗Pro、MDA、H2O2的影响

植物为适应盐碱环境，细胞大量积累渗透调节物质，包括脯氨酸、甜菜碱、可溶性蛋白质、多元醇与糖类等，合成此类物质可防止细胞水分流失，提高植物对盐碱环境的适应能力[23]。本试验中，盐胁迫条件下，接种YM6菌株后玉米植株内Pro质量分数显著增加，提高玉米植株应对盐胁迫的能力；MDA作为检测植物细胞膜质氧化能力的指标[24]，反映植物受逆境胁迫损伤的程度[25]，试验结果表明，当接种YM6菌株后玉米植株地上部分MDA显著低于盐胁迫不接种组，说明YM6菌株可有效降低盐胁迫对玉米植株损伤，陈淋[9]认为这与解淀粉芽孢杆菌参与植物相关耐盐基因调控密切相关。本试验结果发现H2O2与MDA变化一致，研究表明H2O2积累会造成细胞损伤[26]，YM6菌株通过降低玉米植株内氧化物质积累，提高调节渗透剂含量从而减缓盐胁迫损伤[17]，提高玉米植株抗性。

3.3 YM6菌株对盐胁迫下玉米幼苗SOD、POD、CAT活性的影响

SOD、POD、CAT等酶活性变化与植物耐受胁迫程度有关[27]，盐胁迫条件下，玉米植株受胁迫影响，为应对不良环境自身抗氧化物质含量会发生改变[28]。在盐胁迫条件下，接种YM6菌株，玉米植株内SOD、POD、CAT活性上升，从而更有利于清除玉米植株内自由基、降低氧化物积累，缓解盐胁迫损伤，这与刘洪光[29]对于AM真菌对提高枸杞耐盐机理研究一致，但对于YM6菌株诱导其他浓度盐胁迫下玉米植株内抗氧化酶活性变化情况有待进一步研究。

4 结 论

盐胁迫造成玉米植株内氧化物及MDA浓度积累，导致植物细胞受氧化胁迫损伤，细胞形态结构及细胞器发生改变。75 mmol/L NaCl盐胁迫条件下，接种YM6菌株，玉米植株内氧化物及氧化物酶活性均发生改变，POD活性最大值为461.11 U/g(DW)，Pro质量分数最大值为 120.72 μg/g(DW)，YM6菌株增强宿主植物清除自由基的能力，保护植物细胞的超微结构，提高玉米耐盐能力，这与提高玉米耐盐机制密切相关。分析解淀粉芽孢杆菌YM6对诱导盐胁迫下玉米幼苗内氧化酶系及抗氧化物等生理生化指标的影响，为探究PGPR促生机理及盐碱地菌株资源开发利用提供支持。