气质联用法(GC-MS)检测禾谷镰刀菌代谢指纹分析

项 萍，唐 喆

(西北农林科技大学 植物保护学院，陕西杨凌 712100)

小麦赤霉病是世界范围内流行性病害，会导致粮食减产和品质下降。染病作物产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(即呕吐毒素DON)对人畜有很大的毒害作用，直接对人畜健康和生命安全构成威胁[1-2]。禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)是小麦赤霉病的主要致病菌[3-4]，科学家们对禾谷镰刀菌的生长习性、毒素分泌、致病机理、侵染小麦的机理等多个方面进行研究，以期通过生物学方法解决赤霉病害。近年来，代谢组学[5]概念的提出为研究者提供了新的思路，代谢组学主要研究生物体对病理生理刺激或基因修饰所产生代谢物的质和量的动态变化规律。这种整体研究模式可以全面了解代谢物质在疾病发生、发展过程中的变化规律，利用代谢组学分析手段研究真菌基因功能可以丰富真菌基因鉴定的手段，进一步了解抗病机制，最终达到防治病害的目的[6]。

代谢指纹分析(Metabolite fingerprinting analysis)[7-9]是代谢组学研究的方法之一，主要是运用某一种或多种不同的分析手段对细胞内大量代谢物进行扫描分析。代谢指纹分析常用的分析手段有核磁共振(NMR)、傅氏变换红外光谱(FT-IR)以及与MS相联用的气相色谱质谱联用(GC-MS)、液相色谱质谱联用(LC-MS)、高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS)等[10]，其中GC-MS可用于分析挥发性的有机物以及衍生化以后具有挥发性的初级代谢物[11]，并且基于GC-MS具有广泛成熟的数据库便于检索确定物质组成。本研究建立了GC-MS检测分析禾谷镰刀菌代谢产物方法，采用2种衍生化方法进行检测，并对代谢产物指纹图谱进行分析，为禾谷镰刀菌致病机理研究提供参考，为真菌类物质的代谢组学分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP2010气相色谱-质谱仪(Aoc-20i自动进样器、色谱柱型号(Rxi-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm，岛津公司)，SOH-72E高温分解干燥箱(Smart lab公司)，Sep-Pak C18固相萃取柱(6 mL 500 mg，Waters公司)，GY-DCY-24S氮吹仪(海归永电子有限公司)，Vortex-Genie2涡旋震荡器(Scientific Industries公司)，0.45 μm玻璃纤维滤膜(美国PALL公司)。

吡啶(色谱纯，Sigma公司)、氯甲酸甲酯(MCF)(分析纯Sigma公司)、三甲基硅烷咪唑(TMSI)(分析纯，Fluka公司)、三甲基氯硅烷(TMCS)(色谱纯，Sigma公司)、异辛烷(色谱纯，Merck公司)、氯仿(色谱纯，Sigma公司)其他试剂均为国产分析纯试剂，购于天津富宇精细化工有限公司。

1.2 菌株

禾谷镰刀菌野生型PH-1菌株，由西北农林科技大学许金荣实验室保存。

MM培养基：NaNO3(2 g)、 KH2PO4(1 g)、KCl (0.5 g)、MgSO4·7H2O (0.5 g)、蔗糖 (30 g)、FeSO4·7H2O (10 mg)、琼脂(15 g)，加水定容至1 L，调整pH为5.6，121 ℃，灭菌15 min；CM培养基：葡萄糖(10 g)、络蛋白氨基酸(1 g)、酵母提取物(1 g)、蛋白胨(2 g)、NaNO3(6 g)、MgSO4·7H2O(1.023 g)、KH2PO4(1.5 g)、KCl(0.5 g)、琼脂(15 g)加水定容至1 L，调整pH为6.5，121 ℃，灭菌15 min。

1.3 样品处理方法

1.3.1 菌丝样品的制备 将-80 ℃保存的禾谷镰刀菌野生型PH-1菌株活化于小皿上，25 ℃培养4 d；然后用直径1 cm打孔器打孔得到菌饼，接种5个菌饼于50 mL液体培养基，25 ℃ 150 r/min培养10 d；所得到的菌丝用无菌滤布过滤，并用无菌水冲洗干净，再用吸水纸将充分吸干水分，然后放于灭菌研钵中，加入液氮并充分研磨，再转移至50 mL离心管，放于冷冻干燥仪中，干燥过夜，得到菌丝样品。

1.3.2 代谢产物的提取 称取30 mg干燥后菌丝于离心管内，加入6 mL甲醇提取液，在涡旋仪上1 400 r/min剧烈涡旋10 min，直到菌体彻底悬浮，摇动数小时后，离心10 min。转移1 mL上清于2 mL离心管中，使用氮吹仪用氮气吹干，得到菌丝代谢产物样品。

1.3.3 衍生化处理 甲基衍生化：将“1.3.2”所得代谢产物样品加入200 μL NaOH(1%，0.1 g/mL)200 μL甲醇/吡啶混合溶液(体积比 5∶1)、20 μL 氯甲酸甲酯(MCF)，震荡1 min；加入800 μL色谱纯氯仿，上下剧烈颠倒；加入400 μL NaHCO3(50 mmol/L，4.2 g/L)，上下剧烈颠倒，取下层清液于新的1.5 mL离心管中；加入Na2SO4干燥，静置5 min转移500～700 μL于GC-MS进样瓶中，待测。

硅烷衍生化：将“1.3.2”所得代谢产物样品中加入100 μL的1 mol/L HCl，剧烈涡旋10 min，直到管内物质充分接触悬浮；50 ℃孵育1 h，吹干，加入50 μL TMS硅烷化试剂(TMSI∶ TMCS=100∶1)剧烈涡旋10 min，保证管内所有物质与TMS充分接触，37 ℃孵育1 h，加入800 μL色谱纯异辛烷，再加入800 μL超纯水上下轻微颠倒，静置10 min直到分层，转移500～700 μL有机相于GC-MS进样瓶中。

1.4 GC-MS检测方法

1.4.1 甲基衍生化分析方法 载气He，0.9 mL/min；清洗流速3 mL/min，压力：49.3 kPa。

升温程序：柱温60 ℃(5 min)，保持2 min，以8 ℃/min升温至180 ℃保持5 min，以40 ℃/min升温至220 ℃保持5 min，以40 ℃/min升温至240℃保持12.5 min；进样口温度260 ℃；不分流进样；进样量1 μL。

质谱轰击电压70 eV，EI模式，接口温度 260 ℃；离子源温度260℃；检测器电压1.0 kV；溶剂切割时间3 min；扫描范围35～550m/z。

1.4.2 硅烷衍生化分析方法 载气He，1 mL/min；清洗流速3 mL/min，压力：80.8 kPa，分流比5.0。

升温程序：柱温120 ℃(5 min)，保持5 min，以4 ℃/min升温至300 ℃保持15 min；进样口温度260 ℃；进样量1 μL。

质谱轰击电压70 eV，EI模式，接口温度 275 ℃；离子源温度200 ℃；检测器电压1.0 kV；溶剂切割时间3 min；扫描范围35～550m/z。

1.4.3 数据处理 使用岛津气相色谱质谱联用仪自带NIST08和NIST08s两个谱库对结果进行检索，对相似度70%以上的代谢产物进行 指认。

2 结果与分析

2.1 菌丝培养条件对代谢产物的影响

分别选取培养5 d、10 d、15 d、20 d和25 d 5个时间段的野生型PH-1菌株进行测试，观察培养时间对代谢产物的影响，经TMS衍生化后的结果发现培养10 d所得菌丝的代谢产物最充分，大部分产物在总离子流图上的响应值最高，适宜代谢产物的分析，结果见图 1。选用2种不同营养的培养基培养的菌丝样品进行检测分析，结果发现在营养丰富的CM培养基中TMS衍生化处理的代谢产物比营养简单的MM培养基丰富(图2)。因此，后续试验选用培养周期10 d和CM培养基作为培养条件。

图1 PH-1在不同培养时间通过TMS衍生化后的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) plot of PH-1 cultured in different time with TMS derivatization

图2 来自MM和CM培养基中的经过TMS代谢物总离子色谱图Fig.2 Total ion chromatogram(TIC) plot of MM medium and CM medium with TMS derivatization

2.2 MCF衍生化结果分析

采用MCF甲基衍生化后进行GC/MS分析，检测结果总离子流图见图3，根据NIST08和NIST08s谱库指认代谢产物26种，结果见表1，使用面积归一化法计算物质质量分数百分比，其中氨基酸类物质有6种，比例为1.62%；烷烃烯烃类物质9种，占7.4%；7种脂肪酸类物质，占74.52%，其他酯类醛类占16.46%。

2.3 TMS衍生化结果分析

通过TMS硅烷衍生化后进行GC/MS分析，检测结果总离子流图见图4，根据NIST08和NIST08s谱库指认代谢产物37种，结果见表2，使用面积归一化法计算物质质量分数，其中糖醇类物质29种，占96.24%；脂肪酸检测到3种约占1%，另外其他物质主要是麦角固醇类等约占3%。

图3 MCF衍生化野生型赤霉菌代谢产物的GC/MS分析总离子流图Fig.3 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

表1 MCF衍生化野生型赤霉菌代谢产物的GC/MS分析结果Table 1 Result of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

图4 TMIS衍生化野生型赤霉菌代谢产物的GC/MS分析总离子流图Fig.4 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

3 讨论与结论

禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)是小麦赤霉病的一种优势致病菌，能导致小麦产量和品质的严重下降，并产生有害的真菌毒素，给小麦生产的可持续发展带来了很大困难。利用代谢组学分析手段研究小麦赤霉病禾谷镰刀菌所产生代谢物的质和量的动态变化规律，可进一步了解抗病机制，最终实现小麦赤霉病的防治。

气相色谱质谱联用(GC-MS)是代谢指纹分析的常用手段，然而对禾谷镰刀菌的代谢产物分析尚未有报道。本研究构建了禾谷镰刀菌代谢产物的分析方法，通过筛选代谢产物多样化的培养条件，发现10 d和CM培养基为产物多样化的培养条件，进一步针对不易气化的代谢产物，采用2种衍生化方法，分别分析了其代谢产物。其中氯甲酸甲酯(MCF)作为酰基化试剂，衍生化反应迅速、产物单一且结构稳定，能同时衍生有机酸、游离脂肪酸、酚类、氨基酸类和胺类物质，通过MCF衍生化发现了26种代谢产物。其中氨基酸类物质有6种，烷烃烯烃类物质9种，脂肪酸类物质7种，其他酯类醛类4种。硅烷化(TMS)也是常见的衍生化试剂，此类衍生化产物具有易于制备、衍生化后可直接进行气相色谱分析的特点,这样节省了样品制备时间，通过TMS衍生化发现了37种代谢产物，其中糖醇类物质29种，脂肪酸检测到3种，其他麦角固醇类5种。比较该2种衍生化方法，发现MCF衍生化可检测的种类有氨基酸、烷烃烯烃和脂肪酸类等，而TMS衍生化主要检测了糖醇类，二者相互补充。根据以上2种衍生化处理的指纹图谱结果可以看出糖醇类物质和脂肪酸类物质是禾谷镰刀菌的主要代谢产物，其他氨基酸类、烯烃、烷烃等物质质量分数不高，但也是常规存在的代谢产物。

表2 TMIS衍生化野生型赤霉菌代谢产物的GC/MS分析结果Table 2 Result of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

本试验采用2种不同衍生化方法，对禾谷镰刀菌的野生型菌株样品进行了代谢指纹分析共指认出63种代谢产物，质量分数较高的为糖醇类物质和脂肪酸类物质；比较了不同的培养时间和培养基对禾谷镰刀菌代谢产物的影响，发现10 d的培养时间代谢产物最完全，适宜做代谢产物的分析；培养基的营养对代谢产物有一定的影响，营养丰富的培养基培养的菌丝代谢产物相对更丰富。通过以上研究为禾谷镰刀菌深入的代谢组学研究提供参考，也为禾谷镰刀菌致病机理研究提供 依据。