水分散粒剂H14对棉花黄萎病发生及土壤细菌群落的影响

李全胜，孙国清，梁 飞，王国栋，谢宗铭，陈 云

(1.新疆农垦科学院 农田水利与土壤肥料研究所，新疆石河子 832000；2.中国农业科学院 生物技术研究所，北京100081；3.新疆农垦科学院 生物技术研究所/作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000)

由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae Kleb.)引起的棉花黄萎病是新疆棉花生产上最具破坏性的土传病害之一[1]，并且随着耕作年限的延长，其危害性还在不断扩大和加重。目前生产中防治方法主要包括培育抗性品种、轮作倒茬、化学防治和生物防治[2-3]。随着社会经济的发展和农业部“减肥减药”行动的实施，以生物防治为主导的绿色综合防控技术逐步走进农业生产中，并广受群众的信赖和喜爱[4]。针对土传病害的生物防治主要就是利用自然界中的有益微生物来防治各种病原微生物，其中在棉花黄萎病防治上应用较多的是芽孢杆菌、假单胞菌和木霉等[5-7]。随着生防菌菌种商业化开发技术的逐渐成熟，各类生防菌剂已经应用到农田和温室大棚，并在作物病害防治方面取得了一定的防效[8]。

细菌是农田土壤中含量最多的微生物类群，其在土壤碳、氮循环和营养物质转化方面发挥着重要的作用，土壤细菌群落多样性及丰富度同作物生长发育及土传病害防治密切相关[9]。生物防治过程中会有大量的生防微生物被引入到农田中，这种外来生物的入侵势必会对农田中原有微生物群落结构带来影响。因此，有必要开展生防细菌对土壤微生态影响的评价。早期研究微生物群落多样性的方法主要有平板培养计数、微生物生物量测定法、Biolog碳素利用和磷脂脂肪酸PLFA等传统分析方法以及RAPD和PCR-DGGE等分子生物学分析方法，但这些方法存在通量低、操作复杂、周期长、痕量微生物检测困难等弊端[10]。近年来发展的高通量测序技术，具有通量高、周期短、分析深入等优势，成为当前微生物多样性研究广泛采用和认可的技术[11-12]。

IonS5TMXL测序平台利用半导体芯片技术，将化学信号直接转换为数字信号，不需要荧光激发和CCD扫描等环节，同454、Illumina测序平台相比具有快速灵活、成本低的优势，为微生物多样性研究提供更多的选择[13]。莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)H14是农业微生物资源发掘及其应用科研团队筛选获得的1株对棉花黄萎病具有较好防效的生防细菌，后期通过发酵工艺优化和菌剂配方研究，制备了1种水分散粒剂[4,14]。本研究以不施菌剂和施用商业菌剂作对照，采用IonS5TMXL测序平台，分析水分散粒剂H14对土壤大丽轮枝菌数量和细菌多样性的影响，以期为生防菌剂的田间施用提供理论指导和依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地点设在新疆惠远种业股份有限公司棉花黄萎病病圃地，该病圃地连续种植棉花10 a，属黄萎病发病重病田。土壤类型为灰漠土，0～40 cm有机质质量分数平均为12.14 g/kg，碱解氮80.30 mg/kg，速效磷10.08 mg/kg，速效钾 200.46 mg/kg，土壤pH 8.3。

1.2 试验材料

1.2.1 供试棉花品种 ‘新陆早36’由石河子棉花研究所选育，该品种具有早熟和丰产等特点。

1.2.2 供试菌剂 水分散粒剂H14(由作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室制备，功能菌为莫哈韦芽孢杆菌H14，芽孢含量≥ 2×109CFU/g)；商业可湿性粉剂(由河北农林科学院提供，功能菌为枯草芽孢杆菌，有效活菌数≥ 2×109CFU/g)。

1.3 试验设计

试验采用随机区组设计，设水分散粒剂H14灌根(H14)、商业可湿性粉剂灌根(SY)和清水灌根3个处理，且以清水灌根作对照(CK)。每种处理重复3次。2018-04-16播种，1膜6行，行距配置为宽窄行66 cm+10 cm，株距10 cm，小区面积10.25 m2(2.05 m×5.0 m)，共计9个小区。根据当地黄萎病的发病规律，分别在棉花苗期(5月8日)和蕾期(6月22日)灌根施用菌剂，每个生育期施用量为15 kg/hm2，共计30 kg/hm2。

1.4 样品采集及病情调查

1.4.1 土样采集 8月5日采集土样，每个小区随机选5株棉花，每株棉花取根围土混匀，立即用无菌封口袋包扎密封，置于冰盒中带回实验室 -80 ℃保存，备用。

1.4.2 病情调查 8月5日进行棉花黄萎病发病状况调查，发病程度标准参照吕宁等[15]方法分5级，经过统计分析后计算黄萎病的发病率和病情指数，发病率=发病植株数/全部调查植株数×100%，病情指数=发病植株的总病级数/全部调查植株的理论最高总病级数。根围土壤中大丽轮枝菌数量的相对丰度经IonS5TMXL测序平台通过高通量测序获得。

1.5 细菌群落结构分析

1.5.1 16S rDNA PCR扩增 采用土壤基因组DNA提取试剂盒提取各样品中土壤基因组总DNA，用无菌水将DNA浓度稀释至1 ng/μL，作为PCR扩增模板，使用515F/806R引物扩增细菌16S rDNA V4区。PCR扩增体系：Phusion Master MiX(2×)15 μL，模板(1 ng/μL)10 μL，引物F(2 μmol/L)1.5 μL，引物R(2 μmol/L)1.5 μL，ddH2O 2 μL，总量30 μL。PCR循环梯度反应参数：98 ℃预变性1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min，保持 4 ℃直到反应完成。

1.5.2 扩增产物测序 等质量混样PCR扩增产物采用20 g/L琼脂糖胶电泳纯化，回收目的条带，对目的条带进行文库构建和质检，质检合格的文库采用IonS5TMXL进行测序，由北京康普森生物技术有限公司完成测序。

1.5.3 测序数据分析 采用Cutadapt(V1.9.1)软件对测序数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到有效数据。利用Uparse(V7.0.1001)软件对优质序列在97%相似度下进行聚类，得到可操作分类单元(OUT，operational taxonomic unit)的代表序列；采用Mothur(V1.25.0)软件将OTU代表序列与SSUrRNA数据库比对，并进行物种注释(阈值为0.8～1)。利用Qiime(V1.7.0)软件计算丰富度指数Chao1和ACE，多样性指数Simpson和Shannon[16-17]。

1.6 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行整理，采用SPSS 17.0进行Duncan差异显著性检验(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 棉花黄萎病发病状况

由图1可知，CK中棉花黄萎病发病率高达86.74%，病情指数为31.07，发病程度较为严重；而施用芽孢杆菌菌剂后，H14和SY处理中发病率分别显著下降42.35%和39.25%，病情指数分别显著下降52.41%和48.78%(图1)。施用芽孢杆菌菌剂也著降低了根围土壤中大丽轮枝菌的相对丰度，同对照相比，H14和SY处理中大丽轮枝菌相对丰度分别显著下降45.73%和24.47%(图1)，这同发病率和病情指数的变化趋势一致。

图1 不同处理棉花黄萎病发病率、病情指数和土壤中大丽轮枝菌丰度Fig.1 The disease incidence,disease index and relative abundance of Verticillium dahliae in different treatments

2.2 土壤细菌测序信息

采用IonS5TMXL测序平台，对3组处理共计9个土壤样品的细菌16S rDNA的高度变异区V4区进行测序，通过对原始序列整理和过滤后，9个样品共获得561 278条有效序列，其中优质序列为517 453条，占有效序列92.19%，测序质量值(Q20)均大于88%，表明测序质量较高，测序数据准确有效(表1)。优质序列长度分布在220～260 nt，且在253 nt分布最多，平均长度为252 nt，3组处理中有效序列和优质序列最高的均为H14处理土壤样品，有效率最高的是SY处理土壤 样品。

表1 样品测序数据Table 1 Sequencing data of samples

2.3 细菌群落的丰富度和多样性

每次随机选取5 685条序列，采用累加的方法绘制各样品的稀释曲线(图2)。随着序列数量的增多各样品中OTU数量迅速升高；当序列数量增多到28 435条时，各样品的稀释曲线均趋于平坦，表明样品测序数量合理，能够反映各样品中细菌群落组成特征。

在97%的相似度下对样品的有效序列进行聚类，共获得OUT数目为24 353个。全部OTU可划分为54个门、67个纲、135个目、244个科、571个属。各样品中OUT的数量为H14>SY>CK(表2)，但差异不显著。利用Venn图分析各样品细菌群落OTU之间的关系，结果如图3所示，3组样品间共有细菌OTU数目为2 347个，代表的物种分别属于变形菌门657个、放线菌门474个、绿弯菌门236个等，占总OUT的 68.85%；3组样品各自特有细菌OTU数目为 1 062个，特有的OUT数目分别为425个、360个和277个，其中H14处理中土壤样品特有的OUT数目最多。

Chao1和ACE指数可反映土壤细菌群落物种丰富度，由表2可知H14、SY处理土壤样品细菌Chao1和ACE指数相较于CK处理分别增加16.27%和14.71%、13.84%和12.90%。Shannon和Simpson指数可反映土壤细菌群落物种多样性，由表2可知H14、SY处理土壤样品细菌Shannon和Simpson指数相较于CK处理分别增加了2.65%和1.02%、1.38%和0.00%。以上结果表明，施用芽孢杆菌菌剂不仅提高了土壤细菌群落物种的丰富度还增加了物种的多样性，其中H14处理影响效果更为明显。

根据皮尔森相关系数(表3)得出，大丽轮枝菌相对丰度与棉花黄萎病发病率、病情指数分别呈显著正相关，正相关系数为分别为0.789和 0.787；而土壤细菌群落多样性与棉花黄萎病发病率、病情指数及大丽轮枝菌相对丰度呈负相关，负相关系数为-0.572～-0.433。

图2 不同样品的稀释曲线图Fig.2 Rare faction curves of different samples

表2 不同样品的OTU数量和多样性指数(±s)Table 2 Operational taxonomic unit(OTU)and diversity indices of different samples

表2 不同样品的OTU数量和多样性指数(±s)Table 2 Operational taxonomic unit(OTU)and diversity indices of different samples

样品Sample覆盖率/%CoverageOUT 数量OTU number丰富度指数 Richness indexChao1ACE多样性指数 Diversity indexShannonSimpsonH1498.28 388±309 a2 916±503 a2 978±528 a8.90±0.05 a0.99±0.00 aSY98.28 269±245 a2 855±484 a2 931±510 a8.79±0.22 a0.98±0.01 a CK98.67 696±185 a2 508±134 a2 596±103 a8.67±0.13 a0.98±0.02 a

图3 不同样品土壤细菌的韦恩图Fig.3 Venn diagrams of soil bacteria from different samples

2.4 细菌群落分布和组成

根据各OUT中代表序列的物种注释结果，选取各样品根围土壤中细菌在门(phylum)和纲(class)分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度堆积分布图(图4)。由图4-A可知，3组土壤样品细菌在门的分类水平上，最大丰度排名前10的种类为：变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、浮霉菌门(Planctomycetes)、光合细菌门(Oxyphotobacteria)，其中变形菌门、芽单胞菌门和放线菌门在各样品中的百分含量均大于10%，平均丰度为23.97%、26.81%和12.32%。H14处理土壤样品中变形菌门、放线菌门的丰度比CK处理土壤样品分别增加2.82%、28.99%，而芽单胞菌门下降31.81%；SY处理土壤样品中变形菌门的丰度比CK处理土壤样品分别增加 5.10%，而芽单胞菌门和放线菌门下降 7.31%和8.34%。

表3 大丽轮枝菌相对丰度及土壤细菌多样性与黄萎病病情的相关性Table 3 Correlationship of relative abundance of Verticillium dahlia,soil bacteria diversity and occurrence of dieases

注：*表示样本间相关性显著。

Note：* indicate significant correlation between samples.

由图4-B可知，3组土壤样品细菌在纲的分类水平上，最大丰度排名前10的种类为：γ-变形菌纲 (γ-Gammaproteobacteria)、未确定的芽单单胸菌纲(unidentified_Gemmatimonadetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、未确定的光合细菌纲(unidentified_Oxyphotobacteria)、未确定的酸杆菌纲(unidentified_Acidobacteria)。其中γ-变形菌纲、未明确分类芽单胞菌纲和α-变形菌纲在各样品中的百分含量均大于8%，平均丰度为 8.35%、22.88%和10.75%。H14处理土壤样品中γ-变形菌纲和α-变形菌纲分别比CK处理土壤样品分别增加5.99%和11.91%；H14处理土壤样品中γ-变形菌纲和α-变形菌纲分别比CK处理土壤样品分别增加8.22%和8.66%。

根据各属在每个样品中的丰度信息，对3组样品中细菌丰度排名前35的属绘制热图并按照样品和物种两个层面进行聚类(图5)。CK与SY处理优先聚为一类；再与H14处理聚类，可较为明显地看出各土壤样品中细菌群落结构的远近。同时由图4可发现不同样品所包含的主要菌群有着较为明显的差异。芽孢杆菌菌剂处理和对照样品棉花根围土壤样品根际细菌主要有变形菌门(16个属)、放线菌门(7个属)和厚壁菌门(4个属)组成，且以变形菌门种类最多，其中，H14处理土壤样品中优势细菌多数属于放线菌门和厚壁菌门。物种的聚类层面可以得知35个属共分为A、B、C、D四大类群。由图5可知，A类群是SY处理中的优势类群；C和D类群是H14处理中优势类群；而CK处理的优势类群是B类群。A类群包含8个属，其中溶杆菌属(Lysobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)多为生防菌，具有抑菌活性，在防治土壤病害方面发挥着积极的作用[18-19]；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)和苔藓杆菌属(Bryobacter)多为植物益生菌，在土壤碳、氮循环以及磷等营养物质转化发挥着积极作用，从而有利于植物的生长[20]。C和D类群共含18个属，其中芽孢杆菌属(Bacillus)、芽生球菌属(Blastococcus)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)多为生防菌[21]；斯科曼氏球菌属(Skermanella)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)多为氮循环功能菌[22-23]，酸杆菌属(Acidibacter)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)在铁等营养物质转化发挥着积极作用[24-25]。

3 讨 论

同传统的分子生物学方法如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等相比，高通量测序技术在研究土壤微生物群落结构及组成方面具有通量高、速度快、准确率高等优点[11,26]。本研究利用高通量测序技术研究芽孢杆菌菌剂对棉花黄萎病病圃地棉田根围土壤细菌多样性及其群落组成的影响，平均每个样品生成2 673个OUT，划分为54个门、67个纲、135个目、244个科和571个属，覆盖率均大于98%；序列数量增加到一定程度后，稀释曲线趋于平坦，测序深度可靠，可真实反映样品中细菌群落多样性和结构组成。多数农田土壤类型优势菌群主要有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和浮霉菌门组成，本试验高通量测序结果表明各样品优势菌群(含量大于5%)为变形菌门、芽单胞菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门，这与同吕宁等[27]研究多年连作棉田细菌群落多样性的结果基本一致，但菌群的比例存在差异，这可能与棉花黄萎病病圃地同多年连作棉田的土壤生态环境差异有关，致使菌群的物种多样性基本一致，但是菌群的丰富度不同。

图4 门(A)和纲(B)水平上的细菌相对丰度Fig.4 Relative abundances of bacteria at phylum(A) and class(B)

图5 各样品中细菌排名35属的丰度聚类热图Fig.5 Heatmap of bacterial communities based on levels of 35 most abundant genera in each sample

土壤微生物是评价土壤质量的重要指标，并且微生物多样性同土壤健康和土传病害发生有重要的关系[28]。生防微生物的施用有助于提高作物根围土壤微生物多样性，从而抑制土传病原菌的生长繁殖和病害的发生。韩腾等[29]发现灌根施用枯草芽孢杆菌Tpb55提高了烟草根围细菌群落多样性，并能减轻烟草黑胫病发病程度，延迟发病时间。本试验研究结果表明，施用芽孢杆菌菌剂不仅提高了土壤细菌群落物种的丰富度还增加了物种的多样性，而且水分散粒剂H14提高作用更加明显。以往研究发现，同多年连作的重病田相比，健康农田土壤微生物多样性更加丰富[9]，因此施用水分散粒剂H14，更有利于维持土壤中有益菌和病原菌之间的平衡，降低棉田土传病害的发生。3组样品中丰度排名前35的属按照样品和物种两个层面聚类共分为A、B、C、D四大类群，其中A类群是SY处理中的优势类群；C和D类群是H14处理中优势类群；而对照处理的优势类群是B类群，表明不同处理样品均形成了各自的优势菌群。进一步通过对相关菌属的功能分析可以发现，芽孢杆菌菌剂施用后可以提高生防菌相关属的丰度，如A类群中的溶杆菌属、假单胞菌属，C、D类群中的芽孢杆菌属、芽生球菌属和类诺卡氏菌属；另外也提高了参与土壤碳氮循环以及磷铁等营养元素转化相关功能菌的丰度，如A类群的鞘氨醇单胞菌属、生丝微菌属、Bryobacter属，C、D类群斯科曼氏球菌属、亚硝化螺菌属、酸杆菌属和土壤红杆菌属。Wu等[30]研究发现施用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZM9可以显著提高土壤中芽孢杆菌和假单胞菌等生防菌的丰度，并降低了烟草青枯病的发病率。Wan等[20]高通量测序发现马铃薯枯萎病拮抗解淀粉芽孢杆菌SN16-1提高了土壤中类诺卡氏菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属的相对丰度，进一步分析发现这些菌属是通过产生拮抗物质、诱导作物产生抗病性、产生铁载体和促进磷酸盐溶解等方式促进作物生长并提高其抗病性。

本研究施用水分散粒剂H14后，棉花黄萎病的发病率和病情指数较对照处理显著降低，进一步分析发现与之成正相关的大丽轮枝菌的相对丰度也显著降低，而土壤中细菌群落物种丰富度和多样性有所升高。结合水分散粒剂H14施用后土壤细菌属水平上相关生防菌和营养元素转化功能菌的变化，可以归结出水分散粒剂H14可以通过提高防治土传病害、促进土壤碳氮循环和磷铁等营养元素转化的相关菌属的数量，来抑制棉花黄萎病病原菌的生长和繁殖，促进棉花健康生长。