一株促进玉米耐盐碱菌株Bacillus velezensis YM6的发现及鉴定

刘 环，王华笑，杨国平,2，张 琇,2

(1.北方民族大学 生物科学与工程学院，银川 750021；2.宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室，银川 750021)

盐碱化属于土地荒漠化的一种[1-3]，致使土壤肥力下降，植物根系吸水困难，严重影响畜牧业和农业的发展[4-5]。利用生物措施改良盐碱地成为目前备受关注的措施之一[6-10]。近几十年的研究显示，在盐胁迫环境中，植物根际促生细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR)、AM真菌和印度梨形孢等共生菌在降低盐害对植物影响的方面发挥着重要作用[11]。研究发现施用一些改良肥料能促进植物的耐盐碱能力[12]。虽然通过微生物与植物相互作用来增强植物的耐盐性这一现象已经引起人们的关注，但迄今该类微生物菌剂产品尚属少见，将微生物与植物联合起来改良盐碱土的研究更为少见。

本研究通过模拟自然盐碱地生态，同时采用NaCl调节盐离子浓度;Na2CO3调节pH，同时也提供盐离子，盐离子质量分数达到0.45%，且溶液pH达到9.0，为中度盐碱地(pH为8.5～9.5，盐离子质量分数为0.3%～0.6%)的标准，筛选获得能够提高玉米对盐碱地抗性的菌株，并通过菌株形态结合分子生物学分析对其进行鉴定，以期为盐碱化土壤的修复提供参考，对于中国的粮食生产具有重大意义[4]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土样采集 取盐碱地植物根系土壤(表1)。

1.1.2 供试植物品种 ‘郑单958’玉米种子。

1.1.3 试验主要器材 植物光照培养箱，LED 植物生长补光灯，紫外分光光度计，H-3400N扫描式电子显微镜，光学显微镜,VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统。

1.1.4 溶液和培养基的配制 植物营养液为 1 000倍浓缩液，由宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室自制。母液1： CoCl2·6H2O 0.002 g， H3BO31.43 g， MnCl2·4H2O 0.905 g， ZnSO4·7H2O 0.11 g， CuSO4·5H2O 0.051 g， Na2MoO4·2H2O 0.061 g， 去离子水 500 mL；母液2： MgSO4·7H2O 24.648 g，去离子水 500 mL；母液3：K2HPO487.09 g，KH2PO468.443 g，去离子水500 mL；母液4：CaCl2·2H2O 55.495 g，去离子水 500 mL；母液5：FeC6H5O7·3H2O 2.5 g，去离子水 500 mL；母液6：(NH4)2SO40.33 g，去离子水 500 mL。

表1 取样地基本情况Table 1 Basic situation of sampling sites

以上6种母液各取1 mL与1 000 mL蒸馏水混合即得植物营养液，常规灭菌后作为正常的植物营养液。

盐碱胁迫条件确立。溶液Ⅰ：上述6种植物营养液母液各取1 mL加入500 mL蒸馏水中，然后加入3.0 g NaCl，1×105Pa灭菌15 min；溶液Ⅱ 称量0.8 g Na2CO3加入500 mL蒸馏水中， 1×105Pa灭菌15 min；将灭过菌的溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等量混合制得植物生长培养液，该培养液pH为9.0，电导率为7.84，其中盐离子质量分数达到0.45%。

TSB培养基：胰蛋白胨17 g,大豆木瓜蛋白酶消化物3 g，氯化钠 5 g，磷酸二氢钾2.5 g，葡萄糖2.5 g。

TSA培养基:称取TSB 30.0 g，琼脂15.0 g，加入1 000 mL蒸馏水中，1×105Pa灭菌 15 min。

初筛培养基：植物营养液1 mL,0.8 g琼脂，加入1 000 mL蒸馏水中，1×105Pa灭菌 15 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化 分别称取10 g土壤样品捣碎后，加入到装有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡30 min后，进行逐级梯度稀释。取100 μL适当稀释梯度的样品溶液涂布于TSA培养基分离平板。于37 ℃倒置培养24～72 h，用稀释平皿涂抹法纯化3次，获得纯化菌株于4 ℃保藏， 备用。

1.2.2 种子催芽 选取约200粒饱满无损伤的玉米种子置于500 mL 60 ℃温水中浸泡到水温自然降至室温为止，取出玉米种子，用质量浓度为1 g/L的 HgCl表面[13]消毒30 s，再用无菌水冲洗5次。置于铺有湿润无菌纱布的培养皿内，于25 ℃黑暗条件下培养2 d至根长为0.5～1.0 cm，萌发备用。

1.2.3 初筛 平板筛选可促进玉米幼苗耐盐碱的菌株。催芽后种子与试验菌株在盐质量分数为 0.45%,pH为8.50的固体培养中共培养，分为以下3种处理。CK0处理：无盐碱胁迫、不接种试验菌株；CK1处理：盐碱胁迫、不接种试验菌株；菌株筛选处理：盐碱胁迫、分别接种试验菌株，接种浓度为1×108cfu/mL，接种量为每株 20 μL。

每个处理设置3个重复，所有处理均放置于光照培养箱(25 ℃，16 h光照与18 ℃，8 h黑暗，光照度20 000 lx)中培养，共培养3 d后观察玉米的长势，挑选在盐碱胁迫条件下对玉米生长有显著促进作用的菌株作为供试菌株。

1.2.4 复筛 水培法筛选促进植物耐盐碱胁迫菌株。

供试菌株的准备工作：将待试菌株接种到TSA斜面培养基上，30 ℃条件下培养2 d，备用。用接种环挑取待测试菌加入到含有1 mL无菌水的1.5 mL离心管中，制成浓度为1×108cfu/mL的菌悬液，备用。

玉米苗与供试菌株的共培养:选取无污染、长势一致的玉米幼苗，避免选择过大或过小的幼苗。每组6株玉米苗种于含有500 g白石子的培养瓶中，加入80 mL植物生长培养液，分为3种处理(与初筛一致)。

在培养过程中，实时测定营养液的pH，使其保持稳定(pH为9.0±0.2)。

每个处理设置3个重复，所有处理均放置于光照培养箱(25 ℃，16 h光照与18 ℃，8 h黑暗)中培养，共培养14 d后统计玉米的株高、根长、鲜质量和干质量等生长指标。

1.3 菌株YM6的鉴定

1.3.1 培养特征和形态特征观察 将菌株 YM6 划线接种在 TSA 培养基上，30 ℃培养72 h，观察记录单菌落形态；采用革兰氏染色法和电镜法观察细胞形态[14]。

1.3.2 分子鉴定 将纯化好的 YM6菌株送至北京睿博兴科生物技术有限公司提取基因组DNA，然后PCR扩增进行sanger测序，对测序结果进行Blast比对。

1.3.3 菌株YM6对盐、碱及高温耐性测定 将菌株YM6划线接种在TSA斜面上，30 ℃培养72 h，备用；用无菌水梯度稀释制成菌浓度为1×108cfu/mL菌悬液，取1 mL菌悬液分别加入盐质量分数为0、2%、4%、6%、8%、10%、12%的TSB培养液中，180 r/min、30 ℃振荡培养72 h，在600 nm波长条件下以不接菌培养液为空白对照组测定吸光值；用无菌水梯度稀释制成菌浓度为1×108cfu/mL菌悬液，取1 mL菌悬液分别加入装有100 mL的TSB培养液的250 mL锥形瓶中，pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5、 10.0、10.5、11.0，180 r/min、30 ℃振荡培养 72 h，在600 nm波长条件下以不接菌培养液为空白对照组测定吸光值；用无菌水梯度稀释制成菌浓度为1×108cfu/mL菌悬液，取1 mL菌悬液加入装有100 mL TSB培养液的250 mL锥形瓶中，分别置25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和 50 ℃，于180 r/min振荡培养72 h，在600 nm波长条件下以不接菌培养液为空白对照组测定吸 光值。

2 结果与分析

2.1 菌株的促生作用

将由根际土壤样品中分离筛选到的350株分离物与玉米幼苗在平板上培养，共筛选到63株可有效促进玉米幼苗耐盐碱的菌株。这63株菌株与供试玉米在植物生长培养液共培养14d后，供试玉米生长出现明显差异，主要呈现3种结果(图1，2)。

表观无影响型：在植株色泽、株高、根长、茎粗等方面与对照CK1无明显差异，有24株菌。

生长减弱或致死型：菌株与供试玉米共培养后，玉米苗出现生长衰弱或死亡，有3株菌。

表观促生型：供试玉米苗在加入植物生长培养液共生后，长势明显强于对照CK1，有36 株菌。

通过3次重复共培养试验复筛表观无影响型和表观促生型的菌株，最终得到44株在含植物生长培养液的样品中可稳定促进玉米生长的菌株，分别为Sh21、NF38、NF89、NF85、cd52、cd51、cd68、Sm3等。

挑选出效果较为明显且稳定的10株供试菌株与玉米于盐碱胁迫条件下水培，探究生物量差异。

图1 菌株对玉米抗盐碱的影响Fig.1 Effect of strain on salt tolerance of corn

图2 盐碱胁迫条件下菌株与玉米共培养14 d后生长状况Fig.2 Growth status of the strain after co-cultivation with maize for 14 days

盐碱胁迫处理后玉米苗的株高及根长生物量统计结果见表2。在该盐碱条件下，接种上述10株菌对玉米苗在株高及鲜质量和干质量上比对照均分别有不同增加，说明这10株菌均可以增强玉米苗对盐碱胁迫的抵御能力且对玉米幼苗有不同程度的促生作用，通过重复试验，菌株YM6表现最为突出。

2.2 菌株YM6的鉴定

2.2.1 培养特征和形态特征观察 菌株YM6菌落较大，球状或椭球状，乳白色，边缘褶皱，表面光滑，有粘性(图3)，革兰氏阳性菌，可产芽孢，能在碱性条件下生长；在电镜下观察菌体为杆状(图4)，大小基本为(0.4～0.5) μm×(1.0～1.3) μm。

表2 10株菌接种14 d后玉米苗生长状况Table 2 Growth status of maize seedlings after inoculation for 10 strains for 14 days

注：“a、b、c、d、e”表示同列数据差异显著(P<0.05)。

Note:“a,b,c,d,e” means the same column difference significance result(P<0.05).

图3 菌株YM6的菌落形态Fig.3 Colony morphology of strain YM6

图4 菌株YM6电镜观察结果图(×20K)Fig.4 Electron microscopic observation of strain YM6

2.2.2 菌株YM6分子鉴定 根据生理生化及16S rRNA分子生物学鉴定，菌株YM6为Bacillusvelezensis，即贝莱斯芽孢杆菌，该菌株在中国典型微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2018428。

2.2.3 菌株YM6对盐、碱及高温的耐性 经试验测定，在盐质量分数为1%时菌株生长最为良好，菌株YM6最大耐盐质量分数为10%；pH 7～7.5时生长良好，pH达11.0时不能生长；最适生长温度为30～31 ℃，可耐受48 ℃高温(图5)。

3 讨 论

有关促进植物耐盐碱的微生物研究多见于菌根真菌的研究[10,15-18]。但与真菌相比较，细菌更有利于人工培养并进行工业生产。有文献[15]报道，芽孢杆菌属可有效促进植物生长。目前，关于耐受盐碱的细菌资源开发与研究，多聚焦于菌株对盐或碱的单一耐受性的评价[5]；另外，以往研究方法主要采取自然界筛选耐一定盐碱度的细菌，再将耐盐碱菌株与植物在一定盐碱条件下进行互作检测，最终获得耐盐碱菌种，较为耗时耗力[1,4-5]。本研究利用菌株与植物在盐碱环境中的相互作用，直接通过观察植物的根、茎、叶等表观现象，可初步筛选出促进植物在中度盐碱条件下生长的有效菌株。通过上述方法和思路，成功从土壤中分离获得1株具有明显促进玉米耐盐碱性能的细菌，编号为YM6，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，具有较大的应用潜力。本研究存在的不足之处为：在植物生长过程中，根系分泌的有机酸导致水培溶液pH变化程度与在自然盐碱土环境中不一致。因此，筛选到的有效菌株在实际生产中的效果需进一步验证。

图5 菌株YM6耐受性(n=3)Fig.5 Strain YM6 tolerance (n=3)