绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性分析及其稳定性测定

李 通,毛维兴,薛应钰，张树武，徐秉良

(甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

小麦禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae) 属于植物寄生线虫，自1908年在英国首次发现以来，近年已在32个国家发生并引发危害[1]，如在澳大利亚小麦受害面积达2×106hm2，导致减产23%～50%，严重时可达73%～89%，每年造成经济损失高达7000万美元[2]。自1989年在中国湖北天门山首次发现小麦禾谷孢囊线虫以来，现已发现该线虫广泛分布于河北、河南、北京、湖北、甘肃、青海和安徽等省(市)，危害面积超过百万公顷，已成为小麦生产的一个新问题[3-5]。目前，关于植物寄生虫的防治主要采用化学药剂和种植抗病品种，虽然化学药剂杀线活性高，但对环境污染严重、毒性大、残留高且很难降解，进而严重影响人畜健康和有益生物的安全[6]。同时，大多数抗病品种作物在同一区域连作以后，抗性也会逐渐减弱[7]。因此，微生物防治植物病原线虫已成为目前研究的新趋势和新方向[8]。

木霉属真菌(Trichodermaspp.) 作为土壤微生物的主要组成群落之一[9-10]，也是海洋中普遍存在的一类真菌[11-12]。中国物产丰富，地理环境和气候差异多样，木霉菌种类繁多，目前国内已报道的有25种[13-14]。木霉菌具有较强广谱性、广泛适应性和多种拮抗机制等特点，已被作为一类重要的生防菌应用于植物病害的生物防治，但相关报道表明其在田间防治中受到多种环境因素的影响(如温度、湿度、土壤质地、结构和线虫数量等)。笔者从前期分离保存的120株木霉菌中筛选获得一株生长速率快、产孢量和杀线活性强的绿色木霉B3菌株，但目前国内外有关绿色木霉B3菌株对禾谷孢囊线虫毒杀活性及稳定性方面尚未报道和研究。因此，本试验通过绿色木霉B3菌株发酵液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫毒杀活性及其稳定性的测定，以便为植物寄生线虫生防制剂的开发和利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 绿色木霉(T.viride) B3菌株。由甘肃农业大学植物保护学院植物病原学实验室分离保存。

1.1.2 供试线虫 禾谷孢囊线虫(H.avenae) 2龄幼虫，由甘肃农业大学植物保护学院植物病原学实验室分离保存。

1.2 试验方法

1.2.1 绿色木霉B3菌株孢子悬浮液与发酵液制备 向在PDA平板上活化培养6 d的绿色木霉中加入1滴吐温-80(Tween-80) 和5 mL无菌水充分振荡，并使其分生孢子脱落在无菌水中，即得到分生孢子悬浮液的原液，并用血球计数板计数原液的浓度使其为1.0×107个/mL，备用。然后，将PDB液体培养基分装于150 mL三角瓶中，每个三角瓶分装60 mL培养基，并分别加入 1 mL分生孢子悬浮液，以加入1 mL无菌水和1滴Tween-80作为对照，每个处理和对照重复3次，并置于25 ℃、转速为180 r/min和16 h/8 h光照的控温振荡器中连续培养7 d。7 d后，将其通过双层滤膜过滤即得到发酵液的原液，并保存于 4 ℃冰箱，备用。

1.2.2 绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性测定 微波处理稳定性测定:将绿色木霉B3菌株发酵液10 mL置于150 mL三角瓶内，并置于微波炉中(功率800 W)分别处理 10、30、60、120和300 s，待自然冷却后进行杀线活性测定。杀线活性测定参照张树武等[15]方法。将分离的禾谷孢囊线虫2龄幼虫配制成悬浮液，浓度为3～4条/10 μL，保存在50 mL离心管中，备用。然后，利用96孔细胞培养板进行杀线活性测定，每孔取10 μL线虫悬浮液，然后加入90 μL不同条件下处理的发酵液，每个处理组和对照组25 ℃处理线虫24、48和72 h时，分别观察并记录线虫的死亡率。试验过程中每个处理和对照均重复6次。杀线活性测定方法下同。

线虫死亡率=(死亡线虫数/供试总线虫 数)×100%

光照稳定性测定:将绿色木霉B3菌株发酵液20 mL加入不加皿盖的培养皿(d=9 cm) 中，置于照度为4 000 lx可见光的培养箱中分别照射0 h、6 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h和120 h后进行杀线活性测定。试验过程中每个处理和对照均重复6次。

金属离子稳定性测定:利用经灭菌处理的ddH2O分别配制浓度为0.1 mol/L的K+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Fe2+和Zn2+的离子溶液，与无菌发酵液按1∶9体积比混合，4 ℃下放置24 h后进行杀线活性测定。试验过程中以未处理的发酵液作为对照，且每个处理和对照均重复6次。

耐储藏性测定:将绿色木霉B3菌株发酵液各50 mL装入无菌的密封三角瓶中，于4 ℃和室温下分别储藏10～60 d后进行杀线活性测定。试验过程中以未处理的发酵液作为对照，每个处理和对照均重复6次。

酸碱稳定性测定:将绿色木霉B3菌株发酵液各25 mL于三角瓶(规格50 mL) 中，经1 mol/L 盐酸和1 mol/L氢氧化钠分别调整pH至2～12，并于4 ℃冰箱静置24 h后将各处理pH调回发酵液原始pH进行杀线活性测定。试验以未经1 mol/L 盐酸和1 mol/L氢氧化钠处理的绿色木霉B3菌株发酵液作为对照，每个处理和对照均重复6次。

氧化还原稳定性:利用经灭菌的ddH2O分别配制不同浓度的双氧水与亚硫酸钠。将氧化剂双氧水配制为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mol/L 6个浓度梯度，还原剂亚硫酸钠配制为 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mol/L 6个浓度梯度。然后，将各处理浓度的氧化还原剂与发酵液按1∶9体积比混合，4 ℃下放置24 h后进行杀线活性测定。试验过程中以未处理的发酵液作为对照，且每个处理和对照均重复6次。

1.2.3 数据分析 试验数据利用Microsoft Excel 2007整理，采用 SPSS 16.0统计分析软件对数据进行方差分析并做差异显著性检验(Duncan氏新复极差法)。

2 结果与分析

2.1 微波处理对绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性影响

随着绿色木霉B3菌株发酵液处理线虫时间的增加，其发酵液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀活性随着处理时间的增加而增强，尤其处理 72 h时，2龄幼虫死亡率最高为86.82%。同时，绿色木霉B3菌株发酵液经微波处理后，其杀线活性与未处理对照菌株发酵液相比整体无显著差异。处理禾谷孢囊线虫24 h后，经微波处理的发酵液其杀线活性显著高于未处理菌株发酵液，尤其微波处理时间为2.0 min时，其杀线活性最高；处理线虫48和72 h后，经微波处理发酵液与未处理菌株发酵液杀线活性无显著差异(图1)。

不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同 Different letters mean significantly differences(P<0.05)，The same below.

2.2 光照稳定性

研究结果表明，绿色木霉B3发酵液经不同时间段光照处理后，对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀活性与对照相比无显著差异。处理线虫 72 h时，当光照处理时间为6～56 h时，2龄幼虫死亡率均大于80%，尤其发酵液光照处理48 h时，其杀线活性显著高于未处理菌株发酵液，但是随着处理时间的增加，当发酵液光照处理时间为56～96 h时，其杀线活性为71.4%～76.91%，与未处理发酵液无显著差异；当发酵液光照处理时间为120 h时，其杀线活性显著降低(图2)。

图2 光照处理后绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性Fig.2 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain after light treatment

2.3 金属离子稳定性

绿色木霉B3发酵液经不同金属离子处理后，再处理线虫24 h，Ca2+处理的发酵液杀线活性显著高于未处理发酵液；处理线虫48 h后发现Zn2+和Fe3+对线虫的毒杀作用略高于未处理的发酵液；处理线虫72 h后发现K+和Mg2+对发酵液的杀线效果影响较大，与对照相比线虫死亡率分别降低29%和10%，但是Zn2+和Fe3+对菌株发酵液杀线活性无显著影响，表明其稳定性较好(图3)。

2.4 储藏稳定性

绿色木霉B3菌株发酵液在25 ℃下储藏0～40 d后，与对照相比，其发酵液在处理线虫24和48 h后杀线活性无显著变化，但在储藏50和 60 d后，处理线虫24和48 h其杀线活性显著降低。然而，其发酵液在储藏0～60 d后，发酵液处理线虫72 h时，其杀线活性与对照相比均无显著差异(图4)。

2.5 酸碱稳定性

结果表明，不同pH对绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性具有不同程度的影响，尤其在pH=2和pH=12条件下，其发酵液处理线虫24 h后，杀线活性与对照(pH 7.6)相比差异显著，但是在pH为 4～10条件下，其发酵液处理线虫72 h后，杀线活性与对照相比无显著差异。当pH为12时，杀线活性略低于对照(pH 7.6)，但差异较少(图5)。

图3 金属离子处理后绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性Fig.3 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain after metal ion treatment

图4 贮藏一定时间后绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性Fig.4 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain for a certain period of time

图5 不同pH绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性Fig.5 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain with different pH

2.6 氧化还原稳定性

研究结果表明，不同浓度氧化剂H2O2对绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性具有不同程度的影响，当绿色木霉B3菌株发酵液经0.9 mol/L H2O2处理后，其杀线活性显著降低，尤其处理线虫 72 h，线虫的死亡率为66.7%，与对照相比降低16.3%。然而当双氧水为0.3 mol/L时，处理线虫 72 h，线虫死亡率高达90%，与未处理的发酵液相比线虫死亡率增加7%，显著提高B3菌株的杀线活性(图6)。

不同浓度还原剂Na2SO3对绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性具有不同程度的影响，当还原剂Na2SO3浓度为1.1 mol/L时，处理线虫72 h，杀线活性显著降低。然而，当还原剂浓度为 0.9～0.1 mol/L时，杀线活性与未处理相比无显著变化(图7)。

图6 氧化剂(双氧水)处理后绿色木霉B3杀线活性及其稳定性Fig.6 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain treated with oxidant(hydrogen peroxide)

图7 还原剂(亚硫酸钠)处理后绿色木霉B3杀线活性及其稳定性Fig.7 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain treated with reducing agent(sodium sulfite)

3 结论与讨论

绿色木霉(T.viride) 是自然界中广泛分布的一种土传植物病害拮抗生防菌，其在植物病害生物防治中具有重要意义。刘万斌[16]研究表明，绿色木霉HS-4对引起向日葵枯萎病的镰刀菌(Fusariumspp.) 具有良好的抑制作用，其抑菌率为81.46%；安霞[17]研究发现，绿色木霉TV41对辣椒疫病的盆栽防治效果可达82.33%；Gajera等[18]发现，绿色木霉JAU60可以将黑曲霉(Aspergillusniger) 引起的落花生环腐病发生率降低51%～58%；Al-Hazmi等[19]研究发现，绿色木霉和哈茨木霉(T.harzianum)对番茄爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica) 的繁殖和根结的增长有良好的抑制作用，且能够促进番茄幼苗的生长，但是目前国内外有关绿色木霉对植物病原线虫的毒杀作用报道较少。

本试验通过测定微波、光照、金属离子、储藏时间、酸碱、氧化和还原剂等因素对绿色木霉B3菌株杀线活性及其稳定性的影响，表明绿色木霉B3对禾谷胞囊线虫具有较强的毒杀活性，且微波、光照、金属离子和储存时间对其杀线活性无显著影响，能够保持良好的稳定性。另外，本试验发现高酸性和高碱条件对绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性具有显著影响，可能是发酵液中的杀线活性物质在高酸和高碱的条件下发生反应，进而导致其对线虫的毒杀作用降低。同时，不同浓度的氧化和还原剂不仅对绿色木霉B3菌株发酵液杀线的稳定性无显著影响，而且能够提高绿色木霉菌株B3发酵液的杀线活性。褚福红等[20]测定绿色木霉代谢物对芒果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)抑菌率的稳定性，抑菌率达到74.18%，对热、光、微波较为稳定，在pH 6～7时亦较为稳定，与本试验发现绿色木霉B3菌株发酵液在pH 2～10时杀线活性均稳定的结论有所不同。张雯龙等[21]发现链霉菌(Streptomycetaceae) S417发酵液对玉米大斑病菌(Helminthosporiumturcicum) 和香蕉炭疽病菌(Gloeosporiummusarum) 等5种病原菌的抑菌率为82.5%～69.6%，在碱性条件下发酵液的稳定性降低，Cu2+、Fe3+对代谢产物的影响较大，而本试验中绿色木霉菌株B3在pH 2～12条件下均稳定，且防腐剂、氧化剂、还原剂对其影响不显著。本试验表明Zn2+和Fe3+对绿色木霉菌株B3具有良好的稳定性，这可能与不同菌株的生物学特性和微生物的种类等有关。张建华等[22]发现，高温、酸碱、自然光和紫外光处理对长枝木霉T6菌株发酵液抑菌活性无显著影响，在4 ℃和常温下储存60 d其抑菌活性保持不变。这与本研究结果相符合。伊洪伟[23]研究表明，酸碱条件对长枝木霉发酵液抑菌活性影响较大，这与本试验的结果亦相符合。

本研究表明，自然光和微波处理对绿色木霉菌株B3发酵液杀线活性无显著影响，该发酵液抗氧化性、还原性和耐强酸强碱性较强，耐贮藏性也较好。然而有关绿色木霉菌株B3发酵液杀线代谢产物的种类和结构尚待进一步研究。