昆虫取食和机械损伤对葡萄叶片代谢物的影响

高佳敏，高素红,，高宝嘉

(1.河北农业大学 林学院，河北保定 071000；2.河北科技师范学院 生命科技学院，河北秦皇岛 066000)

诱导抗性是系统获得性抗性，是植物抵抗外来刺激的自我保护方式。这种抗性并不会一直伴随着植物而存在，只有在受到外界损伤刺激，例如外力造成的机械损伤，昆虫或其他动物的取食，真菌、病毒等入侵破坏时才能诱发这种反应[1]，由于它特殊的抗性表达方式，一直是近年来研究的 热点。

目前，人们研究较多的诱导因子有生物因子、化学因子和物理因子[2]。利用物理、化学或生物的方法，如昆虫取食、紫外线照射、病菌感染等预先处理植物，使植物产生局部的或者整体的抗性，这就是诱导抗性的含义[3-4]，这些诱导方法已经得到验证，例如，王炳楠等[5]利用从大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的胞外分泌物中分离得到一种蛋白做激发子，成功地诱导烟草植株对烟草花叶病毒(TMV)产生抗性，发病率大幅度降低；张晓晓等[6]利用短波紫外线照射苹果，研究对灰霉病的抗性，结果表明，经照射后苹果果实中的各种防御物质质量分数明显升高，并且显著降低果实灰霉病的发生率。植物经外界刺激或诱导后，会引起植物的一些应激反应，引起植株的生理生化物质质量分数变化，使植物产生抗性。在植物诱导抗性机制的研究中，关注较多的是一些与抗病性相关的酶或其他代谢物质，主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚类、木质素、HRGP等[7-9]。现在人们的研究更多地偏向于2种物质的特异性结合，因为无论哪种途径都涉及到植物与外源因子的特异性结合，因此一定存在特异性激发因子诱导基因表达，从而引起一系列的生理代谢活动[10]。植物可通过受体或感应器与激发子特异性结合而识别昆虫的活动，植物识别昆虫激发子的分子机制尚不清楚，没有一种激发子可以诱导所有植物产生防御反应，这也是以后诱导抗性研究的重点之一[11-13]。

葡萄是酿酒的主要原材料，近年来由于绿盲蝽危害，严重影响葡萄酒的产量，许多研究者也开始寻找绿色无污染的防治方法。研究较多的是外源因子对葡萄抗性的影响，化学物质是常见的诱导因素。已有研究表明，水杨酸可以诱导葡萄丙二醛质量分数的增加，提高SOD、CAT和POD的活性，从而提高植物抗性[14]。物理因素诱导葡萄抗性也在近几年有一些报道。陈贵娜[15]测定紫外诱导下葡萄幼苗内白藜芦醇(天然抗毒素)的质量分数，发现紫外线可以诱导葡萄产生抗性。生物因子也是诱导产生抗性的，但在葡萄上的研究相对较少。一直以来诱导抗性研究大多都集中在非生物因素对植物抗性的影响，对植物-昆虫相互作用的研究较少。利用植物自身抗性抵御植食性昆虫的取食，可以有效减少化学药剂的使用，也符合环境友好型的要求。代谢物质是植物抗性的重要指标，它可以反映植株受到胁迫后保持自身系统稳定的能力，也可以反映植物主动抵抗外界胁迫的能力，因此，明确代谢物质的变化规律，是未来研究诱导抗性的重要依据。

本研究通过测定2种方式处理‘赤霞珠’后，葡萄叶片内8种代谢物质量分数的动态变化，探讨诱导方式和诱导强度与诱导抗性的相关性，也为进一步研究诱导抗性的生理生化与分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样地位于河北省秦皇岛市昌黎县河北科技师范学院实验基地(东经118.45°，北纬 39.72°)，东临渤海，北依燕山，气候属东部季风区、暖温带、半湿润大陆性气候，日光照射充足，四季特征明显，年平均气温11 ℃，年平均降水量638.33 mm。试验样地主要土壤类型是褐土，土层深厚，轻壤质，通气性和透水性良好。 ‘赤霞珠’葡萄均采用硬枝扦插，插条均为前一年的沙藏越冬枝条。在清明前后种植，剪穗长度为10 cm左右，存有2 个饱满的冬芽，扦插前期使用催根粉浸泡24 h，种植株距10 cm、行距30 cm，全年不施用任何农药。选择健康无病虫害、长势一致、健壮的新生嫩叶作为试验材料。

绿盲蝽饲养地点为河北科技师范学院昆虫实验室，饲养方法：将成虫置于透明塑料盒中，用豆角饲养，用80网目的纱网封口，放置一些弯曲的纸条以提高存活率。豆角每2 d更换1次，产卵后的豆角重新晾干用于繁殖。放在智能光照培养箱中(温度为25～27 ℃；相对湿度为50%～70%；光周期为16L∶8D)饲养。

1.2 材料的处理与取样

试验在5-7月进行，选择长势均匀、无病虫害的植株作为试验材料，选择2～3 龄健康的绿盲蝽若虫(不分雌雄)供试验选用。共设置3 个处理，对照、机械损伤处理(用1 号昆虫针模拟机械损伤，每片针叶刺50 下)和昆虫取食处理(5头绿盲蝽取食)，在处理期间均用80 网目的纱网套笼，防止其他昆虫取食，分别在1 d、3 d、5 d和7 d后取样，取枝条顶端绿盲蝽取食过的3～4 片嫩叶，样本迅速放入液氮中，带回实验室，-80 ℃保存，备用。

1.3 测定方法

黄酮测定采用乙醇浸提法，缩合单宁测定采用香草醛法，酚类物质的测定采用Folin-酚法，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法，糖类的测定采用蒽酮比色法，游离氨基酸的测定采用茚三酮显色法，蛋白酶抑制剂类物质的测定采用分光光度计法[16-17]。

1.4 数据处理

用Excel 2003软件进行数据分析，用SPSS 17.0进行单因素方差分析；以LSD和Duncan氏多重比较分析各处理及不同程度取食方式诱导下与对照的差异显著性。数据表示形式是“平均数±标准误”。

2 结果与分析

2.1 不同处理对葡萄次生代谢物质的影响

2.1.1 黄酮质量分数的变化 由表 1 可以看出，在处理1 d后，2 种处理的黄酮质量分数都极显著高于对照(P<0.01)。在处理3 d后，各处理仍高于对照，仅取食处理的黄酮质量分数差异显著(P<0.05)。处理5 d的效果与3 d 相似，取食处理对黄酮质量分数变化的影响更明显。在处理7 d后，机械损伤处理的黄酮质量分数低于对照，而取食处理的黄酮质量分数仍显著高于对照(P<0.05)。综上所述：机械损伤在第1 天诱导效果最明显(与对照相比增加29.2%)，此后效果开始减弱，在处理7 d后低于对照，但是差异不显著；取食处理的效果随着取食时间的增加呈现逐渐上升的趋势，在第7 天达到最大值(与对照相比较增加36.3%)。结果表明，机械损伤和昆虫取食都能诱导黄酮质量分数的变化，昆虫取食效果更显著，机械处理在时效上更及时；从时间上相比，取食处理对黄酮的诱导持续时间更持久。

表1 不同处理下黄酮的质量分数Table 1 Flavonoid mass fraction under different treatments mg/g

注：同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，同列大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，下同。

Note: Lowercase letters in the same columns indicate significant differences (P<0.05);uppercase letters in the same columns indicate significant differences (P<0.01).The same below.

2.1.2 缩合单宁质量分数的变化 如表2所示，取食处理在第1 天和第3 天诱导的单宁质量分数均极显著高于对照(P<0.01)；在处理第5天后，取食处理的结果高于对照，低于机械损伤；在处理第7天后，取食处理与对照相比能够极显著提高单宁的质量分数，总体呈现升高、降低再升高的趋势。与对照相比，机械损伤处理的单宁质量分数在第5 天差异显著(P<0.05)，在第7 天的效果最显著。2 种处理对缩合单宁的诱导效果相似，单宁的质量分数均在第7 天达到最大值(与对照相比较机械损伤增加74.3%；取食处理增加 63.7%)。从第1 天的结果可以看出， 2 种处理相比较，昆虫取食对葡萄缩合单宁的诱导更为迅速；机械损伤对缩合单宁的诱导效果更为稳定，在处理的时间段均高于对照，并在第7 d达到最 大值。

表2 不同处理下缩合单宁的质量分数Table 2 Condensed tannin mass fraction under different treatments mg/g

2.1.3 总酚类质量分数的变化 酚类质量分数的动态变化如表3所示。机械损伤处理1 d后，未起到明显的诱导效果，酚类质量分数极显著低于对照(P<0.01)。在处理第3天后，与对照相比，机械损伤处理效果差异性显著(P<0.05)。在处理第5 天和第7 天，处理效果开始减弱，均未达到显著效果。取食处理对酚类质量分数的影响，在每个时间段都高于对照，除第1 天外，都达到显著差异，酚类的质量分数也呈现逐渐上升的趋势。机械损伤处理的总酚类物质的质量分数先降低再升高，取食处理结果则处于持续升高趋势。结果表明，昆虫取食对酚类的诱导更加快速、稳定，机械损伤对酚类的诱导存在滞后性。与昆虫取食相比，机械损伤的诱导效果相对较差。表明不同处理方式对葡萄叶片酚类物质的诱导效果 不同。

表3 不同处理下酚类物质的质量分数Table 3 Mass fraction of phenolic substances under different treatments mg/g

2.2 不同处理对葡萄叶片营养物质质量分数的影响

2.2.1 氨基酸质量分数的变化 从表 4 可以看出，机械损伤和取食处理的效果相似。 2 种处理均在第1 天 时对氨基酸质量分数的影响最明显，机械损伤处理的氨基酸质量分数变化相比对照增加75.75%，取食处理增加82.58%，均达到显著性差异。在其他3个时间段， 2 种处理的效果均开始下降，但都高于对照。与对照相比，机械损伤在第5天差异显著(P<0.05)；取食处理也在第5天达到显著差异，在第7 天也达到显著差异，并与对照相比增加28.90%。结果表明，机械损伤和昆虫取食对葡萄叶片氨基酸质量分数的处理效果相似，对外界刺激均表现出及时的应答反应。氨基酸是蛋白质的重要组成部分，植物受到外界刺激后会产生一系列防御措施，产生的各种物质大多与蛋白质有密切关系。所以氨基酸质量分数的变化与植物的防御反应有关。

表4 不同处理下氨基酸的质量分数Table 4 Amino acid mass fraction under different treatments mg/g

2.2.2 糖类质量分数的变化 从表 5 可以看出，机械损伤对糖类物质的影响没有明显的规律性，处于波动状态，与对照相比，在 4 个时间段，均没有达到显著性差异。取食处理在第1 天高于对照，其他时间段均低于对照。 2 种处理的结果在 4 个时间段与对照相比有一定差异，但均没达到显著性差异。结果表明，2 种处理对糖类物质的诱导没有明显的规律性。糖类物质是植物代谢活动能量的来源，植物受到外界刺激后，会破坏糖类的合成途径，造成糖类物质不能持续稳定地合成。

表5 不同处理下糖类物质的质量分数Table 5 Sugar mass fraction under different treatments mg/g

2.2.3 蛋白质质量分数的变化 从表 6 可以看出，2 种处理对蛋白质的诱导效果都呈现先降低再升高的趋势，机械损伤处理的结果在第1 天和第3 天低于对照，在第5天和第7天高于对照，分别增加9.1%、31.14%，在第7 天达到极显著差异(P<0.01)。机械损伤处理对蛋白质质量分数的影响在3 d以后开始恢复正常水平。取食处理的效果表现比较及时，在处理1 d后，蛋白质质量分数明显增加，并且差异性显著。除第3 天以外，其他3个时间段都显著提高葡萄叶片内蛋白质的质量分数。蛋白质是生命活动的承担着，是产生各种防御物质的基础物质，植物受到损伤后，自身会产生补偿反应，减少自身的伤害，这可能是蛋白质质量分数增加的原因。

表6 不同处理下蛋白质的质量分数Table 6 Protein mass fraction under different treatments mg/g

2.3 不同处理对葡萄叶片相关酶抑制剂活性的影响

植物体内通常含有多种蛋白酶抑制剂，它能调节植食性昆虫消化道内的蛋白酶活性，降低昆虫的消化功能，从而起到拒食或避食的效果，但通常是微量的，只能对个别昆虫种群有影响，还不能起到控制整个害虫种群增长的作用。当植物被植食性昆虫取食损伤后，其防御系统后接收到信号，其损伤部位的植物组织立刻诱导产生蛋白酶抑制剂诱导因子的损伤激素，但有时这种反应是滞后的，并在很短时间内达到最大值，输向整个植株，达到整株抗性。同时，这种损伤激素会启动植物叶片中蛋白酶抑制剂合成途径，导致蛋白酶抑制剂在体内大量积累，并对取食的昆虫发挥作用。

2.3.1 胰蛋白酶抑制剂活性的变化 如表7所示，与对照相比，2 种处理在第1天和第3天的胰蛋的酶抑制剂活性差异均不显著，在处理第5天，机械损伤处理的胰蛋白酶抑制剂活性极显著低于对照(P<0.01)。绿盲蝽取食处理诱导的胰蛋白酶抑制剂活性在处理的4个时间段中呈上升趋势，在第5 天极显著高于对照(P<0.01)。在处理第7天，机械损伤处理仍然低于对照，而取食处理显著高于对照(P<0.05)。机械损伤处理的效果呈现升高再降低的趋势，取食处理效果处于一直升高的趋势。结果表明：取食处理能够更显著、更持久地诱导胰蛋白酶抑制剂的活性；机械损 伤处理在4 个时间段均没有起到很好的诱导 效果。

表7 不同处理下胰蛋白酶抑制剂的活性Table 7 Activity of trypsin inhibitors under different treatments

2.3.2 胰凝乳蛋白酶抑制剂活性的变化 如表8所示，与对照相比，机械损伤处理的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，在第5 天达到极显著差异(P< 0.01)，在第7 天达到显著差异(P<0.05)，在其他时间段，机械损伤处理与对照相比均未达到显著性差异；取食处理同样在第5 天和第7 天差异显著(P<0.01)，其他时间段均未达到很好的诱导效果。在4个时间段，取食危害处理的结果均高于机械损伤。2种处理下胰凝乳蛋白酶抑制剂活性都呈现先升高后降低的趋势，随着处理时间和处理程度的增加，植物防御系统受损严重，导致胰凝乳蛋白酶抑制剂的合成和分泌受阻，是其质量分数降低的原因。说明2 种处理方法对胰凝乳蛋白酶抑制剂的诱导效果均在第5 天达到显著性差异，存在一定的滞后性，表明危害初期对葡萄叶片内胰凝乳蛋白酶抑制剂的影响不明显。

表8 不同处理下胰凝乳蛋白酶抑制剂活性 Table 8 Chymotrypsin inhibitor activity under different treatment

3 讨 论

本研究结果发现，不同处理对葡萄的诱导效应不同；部分次生代谢物质、营养物质和酶抑制剂类的质量分数随着取食和机械损伤时间的变化而变化；取食和机械损伤处理都能诱导葡萄叶片抗虫效果产生，有些反应不是及时性的，存在一定的滞后效应；取食处理的效果较机械损伤更显著。

3.1 不同处理方法对葡萄诱导抗性的影响

已有试验表明植物在受到为害后产生一系列的防御反应，诱导因素不同，产生的效应不同[18]。研究表明，机械损伤所带来的只是单纯物理刺激，没有其他因素的影响，而昆虫的取食刺激则是比较复杂的过程，不只是单纯的昆虫取食所带来的机械损伤，还有昆虫口腔分泌物引发的化学刺激[19]。所以，昆虫诱导产生抗性的过程更加复杂，这可能是植物防御反应不规律的原因之一，也就导致不同处理方法所产生效果不同[20-21]。

次生代谢物质质量分数的变化是反应植物抗性的重要指标。当受到昆虫取食诱导后，这些次生代谢物质质量分数迅速提高，从而对昆虫的生长发育、存活及繁殖等产生不利影响，单宁与蛋白质在酶的作用下形成不易消化的复合物，影响昆虫的消化率及摄食量[22]。次生代谢物质还会吸引传粉昆虫，或引诱取食昆虫的天敌，从而使植物体获益。因此，植物次生代谢物质具有重要的生态学意义[23]。本研究结果也表明，无论是机械损伤还是昆虫取食，葡萄叶片内黄酮、单宁、酚类物质质量分数均有不同程度的增加，表明植物在积极对外界刺激进行防御，昆虫取食的诱导效果更加明显，说明2 种方法诱导的途径不同，所产生的效果也不同。殷海娣等[24]和严盈等[25]研究证明昆虫唾液中存在诱发因子，能够诱导植物产生抗性，这是与机械损伤的不同之处。因此，昆虫诱导植物抗虫、抗病性机理的研究越来越受到学者的关注。

营养物质是植物和昆虫生长发育所必需的原材料。昆虫通过取食从植物中获取营养，满足自身生长，植物受到损伤后通过改变自身营养物质质量分数来调整自身的营养结构，以达到最适的生存状态。本研究中葡萄叶片受到绿盲蝽取食后各种营养物质的变化规律不同。氨基酸和蛋白质质量分数的升高，可能是植物体的一种应激反应，这种现象会在短时间内发生，但并不会长时间的增加。植物在大量产生一种物质的同时会消耗体内大量的能量，而能量不会供大于求地持续输出；植物体受到损伤，营养物质质量分数短暂的升高，是植物减少伤害的一种防御表现。在本研究的测定的时间段内，糖类物质没有明显的变化规律，可能不同植物的效果不同，或者是试验条件的限制性导致这种现象的发生。

2 种处理方式对酶抑制剂的诱导很显著，总体呈现出先升高后降低的趋势。植物蛋白酶抑制剂对昆虫的生长、发育、取食有重要的影响，昆虫取食蛋白酶抑制剂后会与肠道内的蛋白水解酶特异性结合，降低消化酶类物质的活性，阻断或削弱蛋白酶对肠道内食物中蛋白的水解，进而刺激植物过量合成和分泌消化酶，引起某些蛋白的缺乏，使昆虫的正常代谢紊乱，导致昆虫发育不正常，最终死亡[26]。从试验结果中可以看出，通过适当的机械损伤处理可以取得与昆虫取食相似的效果，这为林木病虫防治提供了新的思路，而找到合适的损伤程度，以达到最大的诱导效果，需要更多的时间去研究和发现。

3.2 不同处理程度对葡萄叶片诱导抗性的影响

本研究结果表明诱导强度与诱导效果存在一定的相关性，但并不是严格的线性关系。植物产生的抗性具有相对性，在适宜的诱导条件下植物会产生诱导抗性，一旦超过某一个阈值，植物抗性就会随着处理强度的增加而降低[26-27]。植物的次生代谢物是体内消耗自身营养物质，并通过一系列的转化所产生。为维持植物体基本生理功能的正常运转、保证植株生长发育的正常进行和防御系统的持续稳定，诱导后次生代谢物质的质量分数在短时间增加后，会逐渐下降到正常水平，也可能会出现低于正常水平的情况。所以植物体并不是持续地大量地表达防御物质，而是随着外界刺激强度的改变有选择地、间断性地、高效地表达以适应外界胁迫[28]。虽然 2 种处理下诱导产生的防御酶种类相似，但在表达量和表达时间上存在一些差异。取食和单纯的机械损伤诱导植物产生的防御机制不同，这是导致两者在物质表达上存在差异的原因。

3.3 环境条件对植物诱导抗性的影响

在不同的环境条件下，植物体受到外界刺激因子的影响，都会引起植物的免疫性应答，引起植物代谢物质量分数适应性的变化。已有研究表明化学因素(如外源激素)、生物因素(如昆虫取食)、物理因素(射线或者物理的机械处理)引起的诱导抗性，都表现出不同的差异性[29-31]。但目前仍有很多关键问题需要解决：自然界中哪些可以作为诱导抗性的诱导因子；植物能够接受的最合理的诱导强度；诱导抗性导致的一些有害物质的积累，对植物是否存在毒害性；诱导产生抗性的挥发物质对其他植物的影响，这些都是在未来研究中需要解决的。研究者不仅要研究人为处理后各物质的动态变化，更要注重自然环境状态下植物诱导抗性产生的机理，外界刺激对植物的作用原理，植物从局部抗性到系统抗性调节的信号分子。随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学的发展，越来越多的技术和工具运用于诱导抗性的研究，更有助于防御性代谢产物合成机制的研究，加快解决上面的问题，促进目标代谢物质的生产和利用。

综上所述，不同的处理方法、处理时间、环境条件等都可能诱导植物的抗性；短期的昆虫取食和机械损伤可以诱导植物产生抗虫性，昆虫取食比机械损伤诱导效果更明显。在害虫危害初期，或经历机械损伤后，一味的使用化学药剂并不能达到很好的预期效果，而且可能杀害传粉昆虫，造成落花落果，在本试验测定的时间段，胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、单宁、酚类物质都是呈现逐渐升高的趋势，这也为充分发挥植物自身抗性，为植物诱导抗性研究提供理论基础，为未来农作物病虫害的综合治理提供依据。