人CD8+T细胞基因调控网络研究

韩鹏勇，塔 娜，宝鲁日，于海泉

(内蒙古大学，省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，呼和浩特 010070)

免疫系统在病毒感染、肿瘤免疫应答等方面有重要作用。Dunn等[3]发现免疫系统对肿瘤存在免疫编辑现象，而免疫逃逸是所有癌症类型的主要特征之一，肿瘤细胞通过招募正常免疫细胞形成肿瘤微环境，影响肿瘤的发生和发展。Reiser等[4]发现免疫系统中的naÏve CD8+T细胞在急性感染时，分化成效应细胞，在病原体清除后以记忆细胞形式长期储存。在慢性感染或肿瘤中，CD8+T细胞变为“功能异常状态”的表型。但肿瘤微环境影响肿瘤浸润性免疫细胞，使其丧失识别和攻击肿瘤细胞的能力，具体作用机制有待深入研究。基因调控网络在细胞分裂、分化、癌变、死亡等生理过程中起关键作用[5]。Corces 等[6]建立一种靠转座酶插入到染色体开放区域结合高通量测序的 ATAC-seq 技术，转录因子在该开放区域的不同位点结合控制下游基因的表达和关闭[8]，结合转录因子和染色体开放区域数据可以绘制特定细胞类型的基因调控网络[9]。通过分析基因调控网络鉴定在特定生物过程中的基因、关键调控因子和局部亚网络[10]，从而揭示癌症特性及癌症病人愈后相关的分子机制和信号调控网络[11]。

Cayuela等[2]发现黑色素瘤占据所有皮肤癌致死率的80%，是危害人类健康的主要癌症之一,目前在其免疫治疗中,免疫检查点抑制剂(抗PD1和抗CTLA4)通过阻断T细胞表面抑制性受体而扩增免疫应答，引起肿瘤细胞的抗肿瘤效应。本试验通过已有ATAC-seq技术研究人黑色素肿瘤浸润性CD8+T细胞数据，构建基因调控网络、转录因子调控网络及细胞表面受体调控网络并进行比较分析，为系统鉴定复杂生理过程中的基因研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 ATAC-seq数据

来自黑色素瘤病人血液中的 naÏve CD8+T(HN)、效应记忆CD8+T(HEM)、中央记忆细胞CD8+T(HCM)，黑色素瘤浸润性功能异常CD8+T[(PD1)数据ID为GSE89308]，来自GEO数据库[12]。

1.2 注释峰文件

通过HOMER软件注释峰文件，得到注释的基因，选取转录起始位点2 kb作为匹配序列[8,13]。

1.3 制作调控网络

采用MEME软件的FIMO(Find individual motif occurrences)模块匹配DNA结合基序的转录因子，将峰的匹配序列与MEME的结合基序数据库进行比对(P<1×10-4)[14]。通过Linux脚本程序鉴定转录因子与其调控的基因，构建基因调控网络、转录因子调控网络、细胞表面受体调控网络，并通过编程寻找每种细胞特异的基因、转录因子和细胞表面受体。

1.4 网络可视化及基因通路富集分析

采用Cytoscape对差异调控网络进行可视化分析[15]，通过Enrichr对差异基因进行信号通路富集分析[16-17]。

2 结果与分析

2.1 基因调控网络构建与比较

通过对3种正常CD8+T类型HCM、 HEM、 HN 和功能异常CD8+T细胞(PD1)的峰文件用HOMER软件注释，选择转录起始位点上下2 kb的bed文件，用FIMO 和Bedtools软件生成的fasta文件进行比对，构建每种细胞的基因调控网络。结果显示HCM 和HEM注释的基因14 084 个， HN注释的基因10 397个，PD1注释的基因14 015个。这 4 种细胞含有10 298个相同基因，如图1所示，与PD1处理细胞相比，HEM和HCM含有69个特异的基因，HN有99个，功能异常CD8+T细胞、HEM和HCM比HN细胞多3 717个基因(图1)。

图1 HCM、HEM、HN、PD1细胞基因调控网络比较Fig.1 Comparison of gene regulatory network in HCM，HEM,HN,PD1

每种细胞特异基因通过Enrichr网站信号通路富集分析(表1)，HN 特异基因富集的信号通路有凋亡与组织稳态相关DNA 片段化通路、颗粒酶 A介导细胞凋亡、蛋白水解、 Notch信号通路、GATA3参与活化 Th2 细胞因子的活化通路等；HEM和HCM特异基因富集的信号通路有Ras通路、Erk PI3K通路、整合素信号通路等。功能异常CD8+T细胞(PD1)特异的信号通路有BRCA1、BRCA2和ATR介导的癌症易感性通路、端粒酶RNAhTERC基因的转录调控通路，雌激素响应蛋白Efp控制的细胞周期等信号通路。

2.2 转录因子调控网络构建与比较分析

以3 种正常CD8+T细胞亚型和功能异常CD8+T细胞(PD1)分别构建转录因子调控网并进行比较分析，HCM和HEM含有475个相同的转录因子，HN含有 365 个，而功能异常CD8+T细胞(PD1)含有 474 个(图2)。与功能异常CD8+T细胞(PD1)相比 ，3 种正常CD8+T细胞亚型中GBEB2转录因子表达关闭，功能异常CD8+T细胞(PD1)、HCM和HEM细胞比HN细胞多 58 个转录因子。

对差异表达转录因子和基因潜在的调控关系进行分析(图3)，发现HEM和HCM细胞中GMEB2转录因子分别调控KCNQ2和RALGDS，HN细胞GMEB2转录因子分别调控KCNQ2、RALGDS和TBCD。与HN细胞相比，功能异常CD8+T细胞(PD1)增加的ZFX转录因子调控51个基因，3 种正常CD8+T细胞中GMEB2转录因子调控KCNQ2和RALGDSPD1，而功能异常细胞中随着GMEB2转录因子的丢失，其调控的基因也丢失，而ZFX转录因子和其调控的相应基因同时被激活。

表1 3 种正常CD8+ T亚型和肿瘤浸润性CD8+ T细胞差异基因信号通路富集分析Table 1 Comparison of differential gene pathway enrichments in 3 CD+8 subtypes and tumor infiltrating CD8+T cells

图2 HCM、HEM、HN、PD1细胞基因调控网络比较Fig.2 Comparison of gene regulatory network in HCM,HEM,HN,PD1

2.3 细胞表面受体调控网络比较分析

从每种细胞基因调控网络提取细胞表面受体，制作相应细胞的表面受体调控网络并进行比较分析(表2)，发现HCM和HEM含有细胞表面受体493个，HN有377个，功能异常CD8+T细胞(PD1)有492个。与功能异常CD8+T细胞(PD1)进行对比，HCM、HEM存在特异的细胞表面受体CD7，HN存在CD7和P4HB。与HCM和HEM相比，PD1没有特殊的细胞表面受体；与HN相比，HCM、HEM和PD1细胞增加117个细胞表面受体。

增加的117个细胞表面受体中，HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G为MHCI相关基因，MMP15、MMP2、MMP25为基质金属蛋白酶基因，参与炎症反应，Fas诱导凋亡，Fas配体参与抗肿瘤效应。对这些特异的受体进行信号通路富集分析，如表3所示，富集的有TCR激活、IL2介导T细胞激活、IL4信号通路、抗原处理与呈递信号通路等，表明HN细胞在受到抗原刺激后，激活T细胞识别和攻击肿瘤的能力。

图3 HEM、HCM、HN、PD1细胞差异转录因子调控网络Fig.3 Differential regulatory networks in HEM,HCM,HN and PD1

细胞类型Cell type和HN相比增加的表面受体Increased cellular receptors in PD1,HEM,HCM in contrast to HNPD1、HEM、HCMACTN2、ADAM17、ADIPOQ、AGGF1、BGN、BST2、C1QBP、C3AR1、C9、CALM3、CALR、CCR10、CD151、CD163、CD1D、CD3G、CD4、CD63、CD70、CD8B、CHID1、CLEC2D、CLU、COL1A1、CP、CTGF、CXCL5、DAG1、DLL4、DSC1、DSCAML1、EMC7、EMILIN1、EPHB1、ESF1、F11R、F2R、FAS、FCGR3A、GCG、GP9、GUCY2D、HGFAC、HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G、ICAM1、ICAM3、IFITM3、IGF2、IGFBP4、IGFBP6、IL12A、IL12A-AS1、IL15RA、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL6、IL6ST、INHBC、ITGA1、ITGA5、ITGAD、ITGB3、ITGB7、ITIH2、ITM2B、JAG2、KIDINS220、LAMB1、LGALS3BP、LMAN2、LPA、LSR、MASP2、MERTK、MET、MFGE8、MMP15、MMP2、MMP25、MS4A1、OSTC、PDGFRB、PILRA、PLXNA1、PPIA、PPT1、PRAF2、PRSS3、PTGDR、PT-PRF、S100A4、S100B、SCARF1、SEMA4C、SFN、SLC30A5、SLC4A2、SLC7A11、SLC9A1、SORT1、SPINT2、ST14、TLR4、TMEM256-PLSCR3、TMEM9、TNFRSF4、TNFSF4、VASN、VCAN-AS1、YIF1A

表3 PD1、HEM、HCM比HN细胞增加细胞表面受体富集的信号通路Table 3 Cellular surface receptors pathway enrichment in PD，HEM，HCM contrast to HN

3 讨论与结论

3.1 4 种细胞的基因调控网络比较分析

对 4 种细胞的基因调控网络比较分析发现，每种细胞有特异的基因，通过对特异基因进行基因通路富集分析发现，HN 特异的信号通路有凋亡与组织稳态DNA片段化通路，颗粒酶 A介导的细胞凋亡，蛋白水解和 Notch通路，GATA3 参与活化 Th2 细胞因子活化通路，Calcineurin角质细胞分化通路。HEM和HCM基因调控网络类似，存在特异的调控网络有Ras通路，Erk and PI-3k激酶通路，整合素信号通路，血管内皮离子通道等。功能异常CD8+T细胞(PD1)特异的信号通路有BRCA1、BRCA2 和ATR介导的癌症敏感性通路，端粒酶RNA成份hTERC基因的转录调控通路，AKAP95在有丝分裂和染色体动力学相关作用通路， PI3K参与的细胞周期通路，雌激素响应蛋白Efp控制的细胞周期和细胞周期素等通路。研究发现3 种正常CD8+T细胞亚型特异基因富集的信号通路有Ras等正常CD8+T细胞功能相应通路，而功能异常CD8+T细胞(PD1)特异表达的基因参与细胞周期、端粒酶等相关信号通路。

3.2 4 种细胞的转录因子调控网络分析

本研究通过对 4 种细胞的转录因子调控网络分析发现，和功能异常CD8+T细胞(PD1)相比，naÏve CD8+T细胞(HN)增加58个转录因子；和HN、HEM、HCM 3种正常CD8+T细胞亚型相比，功能异常CD8+T细胞(PD1)丢失转录因子 GMEB2。在HEM 和HCM细胞的转录因子调控网络中，GMEB2转录因子分别调控KCNQ2和RALGDS，在HN细胞中GMEB2转录因子调控KCNQ2、RALGDS和TBCD。Xiong[25]和Johnson 等[26]发现KCNQ2和RALGDS参与炎症反应，TBCD参与禽H5N1等病毒感染[24]。PD1细胞比HN细胞增加的ZFX转录因子调控1 714个基因。表明丢失的转录因子和特异的基因之间存在相互调控关系。GMEB2是KDWD基因家族成员，基因表达产物会和GMEB1相互作用，参与小病毒DNA复制，如凋亡等糖皮质激素基因相关作用。Kawabe等[25]研究表明IL-12在参与炎症和免疫应答中，通过PI3K/AKt信号通路上调GMEB1/2的表达，会促进T细胞抗凋亡作用。Arakawa等[26]发现GMEB2表达降低会减弱T细胞的抗凋亡功能，该基因是抗炎症反应的重要组成部分。

3.3 4 种细胞的细胞表面受体调控网络分析

对 4 种细胞的细胞表面受体调控网络分析发现，和功能异常CD8+T细胞(PD1)相比，HCM、HEM细胞含有特殊的细胞表面受体CD7，HN细胞有CD7和P4HB。与HCM、HEM细胞相比，PD1无特异的细胞表面受体；与HN细胞相比，HCM、HEM和PD1细胞增加117 个细胞表面受体，与PD1细胞相比，HN增加58 个转录因子存在相互调控关系，其中ZFX转录因子调控51 个细胞表面受体。Garin等[27]发现Galectin-1 (LGALS1) 在调节性T细胞(Treg)中表达选择性升高，结合到T细胞表面受体CD7上。Pace等[28]研究发现T细胞CD7表达上调会引起LGALS1促T细胞凋亡信号。Bi等[29]发现P4HB是一种结合Galectin-9 的蛋白。LGALS1和Galectin-9相互作用会促进T细胞凋亡。CD7和P4HB的表达下降，可下调T细胞的凋亡水平，可能导致T细胞增殖异常，向功能异常状态转变。Philip等[30]发现部分PD1高表达的细胞CD38和CD101高表达，CD5低表达是功能异常T细胞的细胞标记物。Pauken等[31]发现PD1阻断治疗在一定程度上恢复部分功能异常T细胞的表观变化。王涛等[32]发现CD7的一个配体SECTM1在很多肿瘤中都表达。CD7在T细胞和NK细胞中特异表达，表达会活化T细胞。表明CD7和P4HB表达下调会诱导T细胞向功能异常状态转变。

抗病育种从分子标记辅助育种逐渐发展到依靠基因组选择育种[21]，但由于一些性状的复杂会限制分子育种的应用。基因组选择育种是基于分子标记，编辑造成某些特定性状的基因[33]。在新西兰、澳大利亚、英国采用SNP芯片在牛羊上进行辅助育种，存在缺乏合适的表型监控、种群小、花费高等问题[34]。本文通过调控网络研究发现人CD8+T细胞通过转录因子GMEB2表达关闭，ZFX转录因子开启，细胞表面受体CD7 和P4HB表达关闭，关闭正常CD8+T细胞参与的信号通路基因，激活相应基因，转变为一种功能异常状态。在病毒感染和肿瘤中CD8+T细胞都发生功能异常，通过调控网络找到引起功能异常状态关键的基因、转录因子、细胞表面受体；通过基因工程等手段提高特异基因的水平，提高动物免疫系统CD8+T细胞在疾病中免疫应答，为抗病育种寻找特定基因提供理论基础及新思路。