猪丹毒丝菌灭活疫苗制备及其对小鼠免疫效力的评价

陈 章，刘晓露，姚焱彬，吴琼娟，孙 裴，魏建忠，李东风，李 郁

(1.安徽农业大学 动物科技学院，合肥 230036；2.安徽省兽药饲料监察所，合肥 230001)

猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一种急性、热性人畜共患传染病。早在20世纪80年代，该病就与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病，造成巨大的经济损失。随着规模化养猪的发展、抗生素的大量使用以及疫苗的免疫预防，其危害减轻，防控被忽视。然而，近年来，在中国广西、广东、四川、福建、江西、安徽、吉林、黑龙江等多地均有猪丹毒的发生，且呈逐渐严重之势[1]。不仅如此，临床上多见猪丹毒丝菌与链球菌、副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型以及猪蓝耳病病毒等混合感染或继发感染，致使病情复杂化，增加发病率和病死率[2]。

目前，防控猪丹毒的方式主要有抗生素治疗和疫苗免疫。抗生素虽然临床使用效果较好，但随着养殖业中的过度使用和滥用，引起猪丹毒丝菌耐药性的产生[3]。在无抗养殖逐渐成为共识的今天，疫苗免疫仍然是预防猪丹毒最有效的办法。猪丹毒商品化疫苗主要包括猪丹毒灭活疫苗(以血清型2型为主)和弱毒疫苗(以血清型1a型或2型为主)。弱毒苗有毒力返强、加重猪群关节损伤等风险，效果常受到母源抗体和抗生素的影响。罗雪刚等[4]发现猪丹毒弱毒疫苗对现有的流行菌株缺乏较好的免疫保护作用。就安全性而言，灭活疫苗明显优于弱毒疫苗，且相对稳定、可制备多联苗，但存在免疫效力不足、免疫维持时间较短等问题。此外，灭活疫苗质量常受到菌种、抗原含量、灭活剂及佐剂等因素影响[5-6]。

本研究将3株受试菌株(AEr21、AEr31和AEr32)[7]在改良猪丹毒疫苗培养基中培养至稳定期，经终质量浓度为2mg/L的甲醛灭活11h后，用矿物油佐剂ISA201VG制备成灭活疫苗，与商品化疫苗分别免疫小鼠。通过检测免疫小鼠血清IgG抗体、细胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)、CD4+/CD3+和CD8+/CD3+T细胞亚群以及疫苗免疫后对攻毒小鼠的免疫保护率，确定受试菌株制备的灭活疫苗的免疫效果，从而为提高猪丹毒灭活疫苗的免疫效力、有效防治猪丹毒提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 受试菌株：从临床病猪分离鉴定的42株猪丹毒丝菌，血清型均为1a型。首先通过小鼠100% 致死性试验(攻毒剂量为100 cfu/mL)筛选出4株强毒菌株；经致病力试验、抗原性试验和稳定性试验，进一步筛选出3株用于制备疫苗的菌株，分别编号为AEr21、AEr31和AEr32(表1)。由安徽农业大学动物传染病研究室保存和提供。

攻毒菌株：编号为LA 20130329，血清型为1a型，分离自临床急性败血型病猪，对小鼠的LD50为845 cfu/mL，由安徽农业大学动物传染病研究室保存和提供。依据猪丹毒丝菌标准菌株对小鼠的LD50为50 cfu/mL，将LA 20130329确定为攻毒菌株，攻毒剂量设定为100LD50。

表1 3株受试菌株的背景资料Table 1 Background information of 3 strains for producing seedlings

1.1.2 商品化疫苗 猪丹毒弱毒疫苗(GC42株)购自广西丽原生物股份有限公司；猪丹毒灭活疫苗购自浙江诗华诺倍威生物技术有限公司。

1.1.3 试剂 36 g/L酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤培养基 (TSB-YE) 、 48 g/L 酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂培养基 (TSA-YE) 购自绍兴天恒生物科技公司；猪丹毒(疫苗)培养基购自青岛高科园海博生物技术公司；MONTANIDE TM ISA 201 VG矿物油佐剂、葡萄糖购自西陇化工公司；吐温80、氢氧化钠、氢氧化铝均购自国药集团化学试剂有限公司；甲醛购自上海苏懿化学试剂公司；三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 购自博奥拓达有限公司；细胞因子ELISA检测试剂盒(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)购自美国 RB 公司；CD4+/CD8+流式细胞抗体试剂盒购自美国BD公司。

1.1.4 试验动物 体质量为18～22 g SPF级雌性昆明小鼠购自安徽医科大学试验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 灭活疫苗的制备 3株受试菌株(AEr21、AEr31、AEr32)在改良猪丹毒丝菌培养基中培养至稳定期后，经终质量浓度为2 mg/L甲醛37 ℃振荡灭活(150 r/min)11 h，与矿物油佐剂 ISA 201 VG制备成灭活疫苗。经无菌性检验和安全性检验合格后，与商品化疫苗以相同免疫程序免疫小鼠。

1.2.2 免疫小鼠分组 将140只小鼠随机分成6组，A、B、C、D、E组，每组20只，F组40只，包括阴性对照组和攻毒对照组各20只，具体分组见表2。A、B、C组分别为AEr21全菌体灭活疫苗、AEr31全菌体灭活疫苗和 AEr32全菌体灭活疫苗；D、E组分别为商品化猪丹毒弱毒疫苗和商品化猪丹毒灭活疫苗；F组为生理盐水对照组。免疫途径均为皮下多点注射，剂量为0.2 mL(浓度为1.5×1010cfu/mL)。一免14 d后采用同样方式和同等剂量进行第 2 次免疫。

1.2.3 血清IgG抗体检测 采集一免及二免 14 d后各组小鼠的血清，每组5只。参照文献[8]，用纯化的重组SpaA[9]包被酶标板的ELISA方法进行抗体检测。同时用全菌体超声裂解物包被酶标板的ELISA方法进行抗体检测，用包被液将全菌体超声裂解物稀释成10 μg/mL，包被酶标板4 ℃过夜。洗板 3 次后，50 g/L 的脱脂奶粉37 ℃封闭 2 h。洗板 3 次后，血清从1∶25 ～ 1∶819 200(2倍梯度进行)加入板孔，37 ℃作用1 h。洗板 3 次后加入稀释的羊抗鼠 HRP-IgG，反应 1 h。洗板 3 次后加入TMB显色液，室温条件下避光静置 10 min后加入终止液，轻轻振荡后放于酶标仪中测定 OD450。根据待检血清OD(P)/阴性血清OD(N)≥ 2.1的界限判断为阳性，测定其抗体效价。

1.2.4 外周血CD4+、CD8+T 细胞亚群百分比测定 利用小鼠眼球摘除法，分别取一免及二免14 d后的小鼠外周血，每组5只。取100 μL的外周血放入2 mL的离心管中，再加入1.8 mL的细胞裂解液，利用掌上离心机1 500 r/min涡旋8～10 s，生物安全柜中静置30 min。然后1 500 r/min离心5 min，轻轻拿起离心管，弃去上清液。分别在样品管中加入2 mL灭菌PBS缓冲液(pH为7.4)，掌上离心机1 500 r/min 彻底涡旋8～10 s。建立阴性对照组和待检测组。阴性对照共 4 组，第 1 组为不加染料组，另外3组分别加入CD3+、CD4+和 CD8+单一荧光染料；待检测组加入CD3+、CD4+和CD8+3种荧光染料，避光静置30 min。用1 mL的 PBS(pH为7.2)吹洗样品，2 000 r/min 离心5 min后，加入灭菌的PBS调节细胞至105mL-1，转移至流式细胞管中，利用流式细胞仪检测并分析数据。

1.2.5 血清细胞因子检测 一免及二免14 d后，采集小鼠血清，每组5只。按照细胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)检测试剂盒说明书进行各组小鼠血清中细胞因子含量的检测。

1.2.6 免疫保护率测定 二免14 d后，将各组剩余的10只小鼠平均分成2组，一组采用腹腔注射方式攻毒小鼠，另一组采用灌胃方式攻毒小鼠。攻毒菌株为 LA 20130329，剂量为100 LD50，阴性对照组注射等量PBS。计算各组的免疫保护率，收集各组小鼠的内脏(肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)，置于福尔马林(φ=10%的甲醛)中固定并保存。

1.2.7 病理组织切片制作 所有固定的小鼠内脏(肺脏、肝脏、脾脏和肾脏)经常规石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色等步骤，制备成病理组织切片，观察各脏器的病理组织变化。

1.2.8 数据处理 所有数据的绘图采用软件Excel 2007和Graphpad 6.0制作，差异性统计采用 SPSS 20.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)LSD分析处理。

2 结果与分析

2.1 血清IgG抗体检测

采集一免及二免14 d后的各组小鼠血清，应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体。用重组SpaA作为包被抗原，A、B、C、D、E组的二免抗体效价分别为1∶3 200、1∶6 400、1∶1 600、 1∶6 400、1∶3 200，B组和D组免疫小鼠产生的IgG抗体效价最高；用全菌体超声破碎裂解物作为包被抗原，A、B、C、D、E组的二免抗体效价分别为 1∶3 200、1∶6 400、1∶3 200、1∶25 600和 1∶6 400，D组免疫小鼠产生的IgG抗体效价最高(表3)。

2.2 外周血CD4+、CD8+ T细胞亚群百分比检测结果

2.2.1 外周血CD4+细胞亚群在总T细胞中所占百分比 由图1可知，各灭活疫苗免疫组CD4+/CD3+T细胞比率与对照组相比均显著增加(P<0.05)。在A、B、C 3 组中，B组 CD4+/CD3+T细胞的比率最高，组间差异不显著(P>0.05)。与商品化疫苗组相比，二免后D组 CD4+/CD3+T细胞比率最高，且与所有的灭活疫苗组差异显著(P<0.05)。结果显示，二免后，D组小鼠产生的 CD4+/CD3+T细胞比率高于其他疫苗组。

相同免疫后时间内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters in the same number of weeks after immunization indicate significant difference(P<0.05),the same below

图1 小鼠外周血中CD4+细胞亚群在总T细胞中所占百分比
Fig.1 Percentage of CD4+Tsubsets in T cellsafter immunization of mice

2.2.2 外周血 CD8+细胞亚群在总T细胞中所占百分比 由图2可知，在A、B、C 3 组中，B组CD8+/CD3+T细胞比率最高，但差异不显著(P>0.05)。与商品化疫苗组相比，第2次免疫后D组的CD8+/CD3+T细胞比率最高，与C组差异显著(P<0.05)，但与其他疫苗组差异不显著(P>0.05)。结果显示，二免后，C组小鼠产生的CD8+/CD3+T细胞比率低于其他疫 苗组。

2.3 血清细胞因子检测结果

由图3可知，各灭活疫苗组的小鼠血清中细胞因子质量浓度与对照组相比均有所升高，且差异显著(P<0.05)。在A、B、C 3 组中，B组细胞因子质量浓度较高，但组间差异不显著(P> 0.05)。二免后，IL-4和IL-10的质量浓度，D组与A、C、E组差异显著(P<0.05)；TNF-β的质量浓度，D组与C组差异显著(P<0.05)，其他各组间差异均不显著(P>0.05)。结果显示，各疫苗组均可诱导小鼠产生较高水平的细胞因子，其中D组诱导小鼠产生的细胞因子质量浓度最高。

图2 小鼠外周血中 CD8+细胞亚群 在总T细胞中所占百分比Fig.2 Percentage of CD8+ Tsubsets in T cells after immunization of mice

2.4 免疫保护率测定结果

二免14 d后，采用腹腔注射和灌胃2种方式对免疫后的小鼠进行攻毒，结果见表4。阴性对照组(F组)所有小鼠全部死亡，B、D、E 3 组均具有良好的免疫保护水平，保护率为100%。

2.5 各脏器组织病理组织学观察

2.5.1 肺脏 由图 4 可以看出，A1、A3、A4、A6、A7和A8组均无明显病理变化；A2组肺泡壁增宽，严重充血；A5组大量肺泡壁断裂，充血严重；A9组大量肺泡壁断裂，肺泡壁增宽且充血 严重。

2.5.2 肝脏 由图 5 可以看出，B1组少量肝细胞发生变性、坏死，出现少量的肝吞噬细胞；B2组肝细胞发生空泡变性，部分细胞核消失，大量炎性细胞浸润；B3组少量肝细胞胞质浓缩；B4组大量肝细胞胞质浓缩，部分细胞核淡染、消失；B5组肝细胞发生坏死，大量炎性细胞发生浸润；B6组大量肝细胞胞质浓缩，部分细胞核淡染、消失，出现少量的肝吞噬细胞；B7组少量肝细胞胞质浓缩；B8组无明显病理变化；B9组局部肝细胞坏死，大量炎性细胞浸润。

2.5.3 脾脏 由图 6 可以看出，C1组红髓与白髓间隙不明显，大量炎性细胞浸润；C2组充血严重，脾小体肿大，少量炎性细胞浸润；C3组大量炎性细胞浸润；C4 组脾小体肿大，充血严重；C5 组脾小体肿大，红髓与白髓间隙不明显，充血严重；C6组少量充血，大量炎性细胞浸润；C7组充血严重，脾小体肿大；C8组无明显病理变化；C9组充血严重，中央动脉周围细胞疏松，脾小体肿大。

图3 小鼠血清中细胞因子检测结果Fig.3 Determination of cytokine levels after immunization of mice

组别Group感染数Number of infection感染途径Routeof infection接种剂量Inoculatingdose死亡数Number of death死亡率/%Rate of death保护率/%Rate of protectionA5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50120805灌胃 Gavage100LD5012080B5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100C 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50240605灌胃 Gavage100LD5000100D 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100E5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100攻毒对照组 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD5051000Challenge control5灌胃 Gavage100LD5051000阴性对照组5腹腔注射 Intraperitoneal injection等量 PBS Equal PBS00100Negative control5灌胃 Gavage等量 PBS Equal PBS00100

2.5.4 肾脏 由图7可以看出，D1组肾小管上皮细胞肿胀；D2组肾脏充血严重，肾小囊上皮细胞肿胀；D3组肾小管上皮细胞肿胀；D4组肾小球上皮细胞肿胀、充血；D5组肾脏充血严重，肾小囊上皮细胞肿胀、充血；D6组肾小球上皮细胞肿胀、充血；D7组肾小管上皮细胞肿胀；D8组无明显病理变化；D9组肾脏充血严重，肾小球上皮细胞肿胀、充血，肾小囊上皮细胞肿胀。

A1.A组存活小鼠 Surviving mice in group A；A2.A组死亡小鼠 Dead mice in group A；A3.B组存活小鼠 Surviving mice in group B；A4.C组存活小鼠 Surviving mice in group C；A5.C组死亡小鼠 Dead mice in group C；A6.D组存活小鼠 Survival mice in group D；A7.E组存活小鼠 Surviving mice in group E；A8.阴性对照组 Negative control group；A9.攻毒对照组 Drug attacking control group

图4 各组小鼠肺脏病理学组织观察(HE 染色， 200×)
Fig.4 Histopathological observation of lung in each group of mice(HE staining，200 ×)

B1.A组存活小鼠 Surviving mice in group A ；B2.A组死亡小鼠 Dead mice in group A；B3.B组存活小鼠 Surviving mice in group B；B4.C组存活小鼠 Surviving mice in group C ；B5.C组死亡小鼠 Dead mice in group C；B6.D组存活小鼠 Survival mice in group D；B7.E组存活小鼠 Surviving mice in group E；B8.阴性对照组 Negative control group；B9.攻毒对照组 Drug attacking control group

图5 各组小鼠肝脏病理学组织观察(HE 染色， 200×)
Fig.5 Histopathological observation of liver in each group of mice(HE staining，200×)

C1.A组存活小鼠 Surviving mice in group A；C2.A组死亡小鼠 Dead mice in group A；C3.B组存活小鼠 Surviving mice in group B；C4.C组存活小鼠 Surviving mice in group C；C5.C组死亡小鼠 Dead mice in group C；C6.D组存活小鼠 Survival mice in group D；C7.E组存活小鼠 Surviving mice in group E；C8.阴性对照组 Negative control group；C9.攻毒对照组 Drug attacking control group

图6 各组小鼠脾脏病理学组织观察(HE 染色，200×)
Fig.6 Histopathological observation of spleen in each group of mice(HE staining，200×)

D1.A组存活小鼠 Surviving mice in group A；D2.A组死亡小鼠 Dead mice in group A；D3.B组存活小鼠 Surviving mice in group B；D4.C组存活小鼠 Surviving mice in group C；D5.C组死亡小鼠 Dead mice in group C；D6.D组存活小鼠 Survival mice in group D；D7.E组存活小鼠 Surviving mice in group E；D8.阴性对照组 Negative control group；D9.攻毒对照组 Drug attacking control group

图7 各组小鼠肾脏病理学组织观察(HE 染色， 200×)
Fig.7 Histopathological observation of kidney in each group of mice(HE staining，200×)

3 讨 论

猪丹毒作为一种老病新发的疾病，近年来在中国的广州、云南、江苏、安徽等地均有报道，在其他国家诸如美国、日本、加拿大等猪丹毒的检出率也明显增多[10]。从目前的感染情况来看，该病已从单纯感染逐渐演变为复杂的混合感染、继发感染，导致临床上猪群的发病率和死亡率明显升高[11]。急性猪丹毒具有病程短、病死率高等特点，而抗生素的应用存在药物残留、细菌耐药性等弊端，使用率正逐年减少[12-13]。目前，疫苗免疫仍然是防控猪丹毒的首选。

疫苗能否刺激机体产生特异性的体液免疫反应，是用来评价疫苗免疫效果的重要指标。IgG是介导体液免疫的主要抗体，在参与抗感染的过程中扮演重要角色[14]。良好的佐剂不仅有助于增强机体对抗原的免疫应答能力，而且能够使体内产生的IgM完全转换为IgG[15]。包被抗原的质量对ELISA检测抗体水平的灵敏度和特异性具有决定性影响。在猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫刺激的抗体效价比较中，本研究采用全菌体超声破碎裂解物和重组SpaA分别作为ELISA的包被抗原，在用重组SpaA作为包被抗原建立的ELISA检测方法中，AEr31全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒灭活疫苗组的抗体效价最高，均为 1∶6 400；而在用全菌体超声破碎裂解物作为包被抗原建立的ELISA检测方法中，商品化弱毒疫苗免疫组的抗体效价达到1∶25 600。原因可能有：(1)弱毒疫苗与灭活疫苗相比，可在体内繁殖，因而可持续刺激机体产生较高水平的抗体；(2)SpaA蛋白是猪丹毒丝菌的主要保护性蛋白，说明2种疫苗在诱导机体产生主要保护性抗体效果相同，灭活疫苗在灭活过程中可能会使一些非保护性蛋白失去活性，因而在针对全菌体超声破碎裂解物作为包被抗原建立的ELISA检测方法中，抗体效价低于弱毒疫苗刺激产生的抗体效价。

细胞因子是一类具有多功能的蛋白分子，在参与并介导机体免疫反应过程中发挥着重要的作用[16]。Th细胞是机体免疫应答的启动细胞，它能够促进T细胞和B细胞的免疫应答。Th1细胞(辅助性T细胞1)主要分泌TNF-β、IFN-γ、IL-2等，介导着细胞免疫和炎症反应；Th2细胞(辅助性T细胞2)主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等，参与体液免疫。MCP-1作用于Th1和Th2的细胞分化。本研究结果表明，在猪丹毒丝菌灭活疫苗的免疫效果比较中，商品化猪丹毒弱毒疫苗组免疫小鼠后产生的Th1细胞明显优于灭活疫苗组(P>0.05)。T细胞是机体免疫应答的核心细胞，通常检测T细胞相应的CD分子作为细胞亚群的测定指标，一般CD3+作为T细胞的总数，CD4+代表Th细胞，CD8+代表Tc细胞(杀伤性T细胞)[15]。Tc细胞可在Th细胞的辅助下，发挥特异性杀伤或溶解靶细胞的功能，采用流式细胞术的方法检测T细胞可以了解各免疫组诱导小鼠产生的细胞免疫。商品化猪丹毒弱毒疫苗组诱导小鼠产生的CD4+/CD3+T细胞比率明显高于灭活疫苗组，且差异显著(P>0.05)。说明商品化猪丹毒弱毒疫苗在迅速诱导免疫应答的启动方面优于灭活疫苗。商品化猪丹毒弱毒疫苗组诱导小鼠产生的CD8+/CD3+T细胞比率高于灭活疫苗组，且与AEr32全菌体灭活疫苗组差异显著(P>0.05)，与其他灭活疫苗组差异均不显著 (P>0.05)，除AEr32全菌体灭活疫苗外，其他所有疫苗均能诱导小鼠免疫系统特异性杀伤或溶解靶细胞。

猪丹毒丝菌主要是通过消化道或损伤皮肤引起机体产生局部或全身性的感染[17]。当病原进入机体后，在造成机体产生永久性病理性损伤的同时，也引起机体产生一系列的抵抗反应行为。炎症的本质是机体在应对病原菌入侵时引起损伤产生的一种防御性反应[18]。本研究结果表明，由抗原所引起的特异性免疫细胞在诱发慢性炎症中具有重要作用[19]。在免疫效力检验过程中，本研究采用腹腔注射和模拟自然感染的灌胃2种方式对免疫后的小鼠进行攻毒。2种攻毒方式的攻毒对照组的小鼠全部呈急性死亡且肺脏、脾脏、肝脏及肾脏充血严重，肾小球、肾小囊上皮细胞及脾小体肿胀，部分肝细胞坏死。AEr21全菌体灭活疫苗组和AEr32全菌体灭活疫苗组，腹腔攻毒的保护率分别为80%和60%，灌胃的保护率分别为80%和100%。病理组织切片观察可见小鼠的肝细胞出现变性、坏死，产生少量的肝吞噬细胞(KCs)。KCs具有吞噬血液循环的抗原抗体复合物、清除肝血窦中的细菌以及清除衰老的红细胞等作用[20]。KCs的产生是因为免疫后的小鼠机体被病原菌刺激，增大KCs的体积，从而导致其数量上的增多。脾脏虽出现脾小体肿胀，但部分细胞核出现渐染的现象，这一现象说明免疫小鼠的机体对组织损伤进行一定的自我修复，经修复后可恢复原组织的结构和功能[9]。AEr31全菌体灭活疫苗组、商品化弱毒疫苗组和商品化灭活疫苗组对二种攻毒的保护率均为100%，且各脏器病理变化较轻，免疫效果较好。

本研究以3株猪丹毒丝菌制苗用菌株(AEr21、AEr31和AEr32)为受试菌株，矿物油佐剂ISA 201 VG作为制备灭活疫苗的免疫佐剂。在猪丹毒丝菌灭活疫苗的免疫效力研究中进一步证实：(1)灭活疫苗的免疫效果与制苗用菌株的免疫原性有关。AEr31株制备的灭活疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫以及免疫保护率均最高，AEr31株制备的灭活疫苗的抗原性优于其他菌株。(2)灭活疫苗的质量与抗原的质量浓度以及免疫佐剂的性质有关。在与商品化猪丹毒灭活疫苗的免疫效力比较中，AEr31全菌体灭活疫苗组诱导小鼠产生的抗体水平和细胞因子水平优于商品化猪丹毒灭活疫苗，对免疫后小鼠能提供100%的保护，AEr31全菌体灭活疫苗可作为防控猪丹毒的候选疫苗。(3)疫苗安全性是前提，免疫效力是关键[21]。在与猪丹毒弱毒疫苗免疫效果比较中，虽然弱毒疫苗诱导机体产生细胞免疫和体液免疫方面优于灭活疫苗，但有研究报道，猪丹毒弱毒疫苗对于慢性型猪丹毒的效果较差，甚至会加大猪群感染关节炎的风险，免疫的效果也常受到猪群母源抗体和抗生素干扰的影响[22]。而本研究结果可有助于提高猪丹毒灭活疫苗的免疫效果，也为猪丹毒有效防控提供技术储备。