续随子 ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表达特性

孙超超，葛丽萍,，任国鹏，李润植

(1. 山西农业大学 林学院，山西太谷 030801；2. 山西农业大学 分子农业与生物能源研究所， 山西太谷 030801；3. 北方功能油料树种培育与研发山西省重点实验室，山西太谷 030801)

续随子(EuphorbialathyrisL.)又名千金子、菩萨豆、小巴豆等，属大戟科大戟属的1a生或2a生草本植物[1-2]，原产于欧洲[3]。续随子种子含油量较高，油脂质量分数约为45%～60%，主要成分包括棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)、亚麻酸(18∶3)等，其中油酸(18∶1)质量分数可高达总油脂的84%以上。油酸作为不饱和脂肪酸，有利于人体消化吸收、软化血管、防止血栓形成等作用[4]，还可以降低人体血液中胆固醇质量分数，降低动脉硬化发生的概率[5]。相关研究表明，续随子种子油脂与理想柴油替代品C19H36O2的分子组成类似[6-7]，是一种经济利用价值较高的生物质能材料[8]，因此，续随子也被誉为“石油植物”。而目前关于续随子种子油脂代谢的研究甚少，其油脂生物合成及调控机制的研究也未见报道。

植物油脂主要以三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)的形式贮藏在种子中，三酰甘油的合成是由细胞内一系列的酶促反应完成的，其中二酰甘油酰基转移酶1(Diacylglycerol acyltransferase，DGAT1)是催化植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的关键酶和限速酶[9-10]，它催化酰基-CoA链上的脂酰基转移到sn-1,2-二酰甘油(DAG)分子的sn-3碳原子上生成三羧酸甘油酯[11]。已有研究表明，DGAT1能够提高种子含油量，而对该酶的研究被认为是提高油脂质量分数的最佳途径[12-16]。例如，在拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)中超表达旱金莲(TropaeolummajusL.)的TmDGAT1可使拟南芥种子油质量分数提高3.5%[12]；在油菜(BrassicanapusL.)种子中超表达油菜的BnDGAT1可使种子含油量提高14%[13]；Zheng等[14]发现过表达高油玉米(ZeamaysL.)DGAT1基因可使玉米种子含油量、油酸质量分数分别提高24.9%和84.5%。目前，烟草[15]、油菜[13]、蓖麻[16]等油料植物的DGAT1基因相继被克隆研究，而针对续随子ElDGAT1基因的克隆及功能分析尚未见报道。

本试验依托续随子转录组数据，从续随子种子中克隆获得ElDGAT1基因，利用生物信息学方法分析ElDGAT1蛋白的序列特征，并运用实时荧光定量技术研究该基因在不同器官中的表达特性，为进一步研究ElDGAT1基因的功能及续随子种子油脂的生物合成积累机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用续随子种植于山西农业大学林学院苗圃，分别取根、茎、叶、花及种子发育的3个不同时期S1(开花后15 d)、S2(开花后30 d)、S3(开花后45 d)，液氮速冻后，于-80 ℃保存备用。

1.2 方 法

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 ElDGAT1蛋白的基本结构及系统发育分析ElDGAT1基因编码的氨基酸序列和开放阅读框(ORF)运用在线软件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析；ElDGAT1蛋白的基本理化性质借助ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析软件；跨膜区和信号肽的分析分别采用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测；利用NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对ElDGAT1蛋白的功能结构域进行分析；ElDGAT1蛋白二级结构以及三维结构建模分别利用SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进行预测；运用MEGA 7.0多序列比对软件构建续随子及其他物种DGAT1蛋白序列的系统进化树，并根据同源性来预测ElDGAT1蛋白的功能。

2 结果与分析

2.1 ElDGAT1基因克隆

使用高保真酶对续随子S3时期种子cDNA进行RT-PCR扩增，扩增产物电泳分离结果显示(图1)：获得长度为1 530 bp的目的条带，割胶回收目的片段纯化并测序，后续将测序结果与转录组数据进行比对分析。

M.DL2000 Marker；1.ElDGAT1基因扩增产物ElDGAT1gene amplification product

图1ElDGAT1基因PCR扩增产物电泳结果
Fig.1 Electrophoresis of amplified PCRproduct ofElDGAT1gene

2.2 ElDGAT1蛋白的基本结构及系统发育分析

通过对ElDGAT1基因开放阅读框分析可知(图2)：ElDGAT1基因全长为2 376 bp，编码区长1 530 bp，共编码509个氨基酸。预测ElDGAT1基因编码蛋白的理化性质，其化学分子式为C2675H4121N691O702S31，分子质量为58.19 ku，等电点pI为8.89，不稳定系数为51.25，脂溶系数为101.67，亲水性系数为0.284，推测ElDGAT1蛋白为疏水性膜结合蛋白。跨膜区和信号肽预测存在9个典型的跨膜螺旋区，不存在信号肽；亚细胞定位预测该蛋白结合在内质网上。

NCBI-CDD在线预测ElDGAT1蛋白的功能结构域，图3表明：ElDGAT1蛋白在第61～506位氨基酸具有特定匹配的结构域PLN02401(diacylglycerol acyltransferase)，属于MBOAT膜蛋白家族(MBOAT superfamily)，该家族含有多种酰基转移酶，具有特定的酰基转移功能，据此预测ElDGAT1蛋白同样具有酰基转移功能。

PLN02401.二酰甘油酰基转移酶特定匹配的结构域 Diacylglycerol acyltransferase specific hits；MBOAT superfamily.膜结合O-酰基转移酶超家族 Membrane bound O-acyl transferase

图3 ElDGAT1蛋白质功能结构域分析
Fig.3 Analysis of the domain of ElDGAT1 protein

运用SPOMA对ElDGAT1蛋白的二级结构进行预测可知：ElDGAT1蛋白由α-螺旋 (47.74%)、β-转角(3.73%)、延伸链(11.00%)和无规则卷曲(37.52%)4种结构元件组成。使用SWISS-MODEL预测ElDGAT1蛋白的三级结构(图4-a)，其三级结构与模板6bug.1膜蛋白的晶体结构(图4-b)相似度为18.92%，它包含D-丙氨酸载体蛋白(D-alanyl carrier protein)和D-丙氨酰转运蛋白DltB(D-alanyl transfer protein DltB)，且属于膜结合的O-酰基转移酶超家族(MBOATs)，这与NCBI-CDD对ElDGAT1蛋白的功能结构域预测结果相符，据此推测ElDGAT1蛋白具备二酰甘油酰基转移酶功能区，即有酰基转移功能。

利用MEGA7.0软件对续随子及乌桕(Triadicasebifera)、橡胶树(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、油桐(Verniciafordii)、麻疯树(Jatrophacurcas)等DGAT1的蛋白序列进行比对分析，构建系统发育树，为更加真实地反映植物DGAT1蛋白的系统发育过程，本研究以拉曼被孢霉的DGAT蛋白作为外类群。结果显示(图5)：续随子与同为大戟科的蓖麻、麻疯树、油桐、乌桕、橡胶树及木薯这6种同科植物被聚在同一个分支中。而在这个分支中，续随子与乌桕亲缘关系最近，构成了一个小分支，同源性高达86%。此外，续随子与橡胶树和木薯的同源性 次之。

2.3 ElDGAT1基因在不同器官中的表达特性

由图6可知，ElDGAT1基因在续随子的根、茎、叶、花及种子中均有表达，但在不同器官中的表达量有所差异。ElDGAT1基因在种子中的表达量相对较高，其种子的S1、S2、S3 3个时期的表达量呈逐渐升高趋势；根系和叶中的表达量低于其他器官，且根中表达量最低；而在茎和花中的表达量略低于S1时期。

3 讨 论

续随子是一种开发前景广阔的新型能源油料作物[19]，且其脂肪酸组分与理想柴油替代品的分子组成相似，是中国生物燃油发展的理想原料[20-21]。研究表明，DGAT是植物油脂合成途径中催化三酰甘油合成的关键酶，对于调控种子油脂合成发挥着重要作用[22]。

本试验分离鉴定续随子ElDGAT1基因，并获得了续随子中编码ElDGAT1基因的全长cDNA序列。ElDGAT1基因cDNA序列全长2 376 bp，CDS序列长1 530 bp，共编码509个氨基酸。预测ElDGAT1蛋白定位于内质网上，为疏水性膜结合蛋白，不存在信号肽，含有9个典型的跨膜螺旋区，具有PLN02401结构域，属于MBOAT蛋白超家族，这与前人在玉米[14]、烟草[15]、大豆[23]等植物中DGAT1的分析结果相似。ElDGAT1蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，其中 α-螺旋最多，占47.74%；其三维结构与模板6bug.1膜蛋白的晶体结构相似度为 18.92%，且该模板有2个蛋白结合位点，具备二酰甘油酰基转移酶功能区，进一步表明该蛋白有酰基转移功能。基于DGAT1蛋白的系统发育分析显示：续随子与同科植物乌桕的亲缘关系最近，同源性高达86%，与橡胶树和木薯的同源性次之，而这4种植物同属于大戟科，即系统发育分析结果和传统分类划分相吻合，表明不同植物间蛋白同源性分析可为进一步分析其亲缘关系提供一定的参考。

图5 ElDGAT1与不同物种DGAT1蛋白的系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ElDGAT1 and other DGAT1 proteins from different species

小写字母表示在0.05水平方差分析的差异显著性 Lowercase letters indicates significant difference at 0.05 level

图6 不同器官中ElDGAT1基因表达特性分析
Fig.6 Relative expression level ofElDGAT1gene in different organs

续随子ElDGAT1基因在种子发育的3个时期上调表达，表明ElDGAT1基因在续随子积累油脂的种子中，随着种子的发育ElDGAT1基因的表达量也逐渐升高，这与本课题组元博[24]近年来对续随子生长发育旺盛时期其种子油脂积累特性的研究结果相符。qPCR检测显示：ElDGAT1基因在续随子不同器官中均有表达，且在种子中表达量最高，远高于叶片。另有研究表明，在油料作物种子发育阶段，油脂积累速率与DGAT表达情况之间存在明显的正相关性[10]。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1的研究表明，在蓖麻种子油脂积累的高峰期，随着RcDGAT1活性增强，种子油脂质量分数也显著增加[25]。在大部分高等植物中，DGAT1与种子发芽、幼苗发育以及TAG合成等过程均有密切关系，并且在植株的各器官中均表达，其表达情况有明显差异。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1在各器官中均有表达，而旱金莲TmDGAT1只在发育的种子中表达[12]。另外，DGAT1基因在许多双子叶植物，如大豆、油菜等在植株中的表达情况与模式植物拟南芥相似[26-28]，拟南芥AtDGAT1在种子萌发、幼嫩的花芽和花瓣中表达量明显高于叶和茎[26]，这与续随子ElDGAT1基因在茎和花中的表达量明显高于根和叶片，在种子不同生长发育时期表达量呈递增趋势有所不同，这表明ElDGAT1基因在续随子中有其独特的表达特性。目前，烟草[15]、油菜[16]、大豆[23]、蓖麻[25]等植物的DGAT1均已被克隆研究，并对其功能做了相关验证。本研究对续随子的ElDGAT1基因也成功克隆，但对其功能的验证还需后续更深入的研究。

4 结 论

本试验通过克隆获得了续随子ElDGAT1基因，并运用生物信息学方法系统分析了该基因的理化性质，利用qPCR技术研究ElDGAT1基因在续随子不同器官中的表达谱。结果表明：ElDGAT1基因ORF为 1 530 bp，编码509个氨基酸。预测其编码的蛋白定位于内质网上，且含有9个典型的跨膜螺旋区，具有酰基转移酶的功能。另外，续随子积累油脂的种子中ElDGAT1基因表达量高于其他器官，而且随着种子的发育表达量升高。本试验研究了续随子中ElDGAT1基因在油脂合成积累过程中的表达特性，为ElDGAT1基因的功能鉴定以及后续续随子中调控油脂合成高表达基因的转化应用提供依据。