苹果煤污病菌分离中污染细菌的鉴定及抑菌抗生素的筛选

李焕宇，李 彰，辛岳山，徐秉良

(甘肃农业大学 植物保护学院，兰州 730070)



苹果煤污病菌分离中污染细菌的鉴定及抑菌抗生素的筛选

李焕宇，李 彰，辛岳山，徐秉良

(甘肃农业大学 植物保护学院，兰州 730070)

为明确煤污菌分离中污染细菌的组成，筛选可抑制污染菌的抗生素，对煤污病菌分离中伴随的污染细菌进行纯化，通过16S rDNA序列分析对代表性纯菌株进行鉴定，并采用滤纸片法测定9种抗生素对供试细菌菌株的抑菌效果。结果表明，煤污病菌分离中污染细菌的组成复杂多样，至少包括9个属，分别是微杆菌属Microbacterium、短小杆菌属Curtobacterium、考克氏菌属Kocuria、葡萄球菌属Staphylococcus、芽孢杆菌属Bacillus、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Aureimonasi及2个未确定属，这2个属分别与草药菌属Herbiconiux和甲基杆菌属Methylobacterium相近。不同抗生素对供试细菌菌株的抑菌效果差异很大，庆大霉素和卡那霉素对所有供试细菌菌株都有抑制作用，链霉素、新霉素和金霉素分别能够抑制98.08%、96.15%和90.38%的细菌菌株；四环素、萘啶酮酸和青霉素分别只能抑制42.31%、9.62%和9.62%的细菌菌株，氯霉素对所有的细菌菌株都无抑制作用。因此，在煤污病菌的分离培养中可使用庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素和金霉素抑制细菌污染。

煤污病菌；细菌污染；抗生素

苹果煤污病菌是生活在苹果果实表面的一类外寄生真菌，种类复杂多样[1-2]。苹果煤污病菌对常用的表面消毒剂敏感，对该类真菌的分离一般采用直接挑取法[3]。但苹果果实表面存在大量的微生物，特别是细菌[4]，导致在煤污病菌的分离过程中常常伴随细菌污染，污染率可高达50%。细菌污染是煤污病菌分离、纯化中的一个严重问题，因为煤污病菌大多生长缓慢[3]，一旦出现细菌污染，会导致煤污病菌不能生长，或者能够生长，但速度更为缓慢，使得之后的纯化更为困难。

真菌培养中抑制细菌污染的方法比较多，如添加乳酸、双层平板法、添加抗生素等[5]。其中，添加乳酸的方法比较简单，但只能抑制细菌的生长，纯化过程中被抑制的细菌极易恢复生长[6]；双层平板法操作较繁琐，且易造成二次污染，或者将细菌带到第二层培养基的表面[7]。相较而言，在培养基中添加抗生素是较好的方法，但可供选择的抗生素较多，不同抗生素的抑菌效果往往随目标细菌的变化而不同[8]。

煤污病菌分离过程中伴随的污染细菌有哪些，目前尚无相关报道；哪些抗生素对这些污染细菌的抑制效果较好，亦无相关研究。本试验对煤污病菌分离中得到的污染细菌进行鉴定，并比较9种抗生素的抑菌效果，旨在明确煤污病菌分离中污染细菌的组成，筛选到抑菌效果较好的抗生素，这对于煤污病菌分离培养中有效抑制细菌污染有很大实用价值，同时也为其他真菌分离培养中抑制细菌污染提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌源 2014年煤污病菌分离过程中伴随的污染细菌。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水1 000 mL。

马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 供试抗生素 青霉素(青霉素G钾盐，Solarbio)、四环素(盐酸四环素，Amresco)、金霉素(盐酸金霉素，Solarbio)、链霉素(硫酸链霉素，Solarbio)、卡那霉素(硫酸卡那霉素，Amresco)、庆大霉素(硫酸庆大霉素，Amresco)、新霉素(硫酸新霉素，Amresco)、氯霉素(Solarbio)、萘啶酮酸(Solarbio)。其中，新霉素和氯霉素的使用质量浓度为100 μg/mL，其余抗生素的使用质量浓度为50 μg/mL[5,9]；链霉素用φ=70%乙醇溶液配制，其余抗生素均用无菌水配制。

1.2 试验方法

1.2.1 污染细菌的纯化和培养 将所得污染细菌在PDA平板上划线培养，挑取单菌落转移到PDA斜面上，28 ℃黑暗培养3～5 d后，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 污染细菌的鉴定 菌落及菌体形态观察：首先在PDA斜面上活化菌株，再划线转接至PDA平板上，28 ℃黑暗培养3～5 d，观察单菌落特征，革兰氏染色后观察菌体形态和染色反应[5]。

16S rDNA序列分析：选取代表性细菌菌株，用SDS法提取基因组DNA[10]，使用通用引物27f和1492r对16S rDNA进行扩增，扩增体系和扩增程序按照李振东等[11]的方法，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工测序。测得序列经校对、拼接后，在GenBank中通过Blast搜索下载相似性较高的序列，用PAUP v. 4.0b10软件构建形态发育树[12]。

1.2.3 抗生素的筛选 含菌平板的制备：将保存的细菌纯菌株接种至100 mL无菌PDB培养液中，28 ℃振荡培养72 h进行菌种活化，转速180 r/min。将活化好的细菌菌液加入经灭菌并冷却至45 ℃左右的600 mL PDA 培养基中，摇匀后制备含菌平板。

滤纸片法测定抗生素的抑菌作用：将无菌滤纸片(6 mm)用制备好的无菌抗生素溶液全部润湿，放置在含菌平板上，每个含菌平板上放置7个滤纸片，以无菌水润湿的滤纸片为对照；每个菌株每种抗生素设置3个重复。28 ℃黑暗培养24 h后，观察有无抑菌圈的产生。

数据处理：对每种抗生素记录每个细菌菌株是否产生抑菌圈；若产生抑菌圈，采用十字交叉法测量抑菌圈的大小，计算每个平板上7个抑菌圈的平均值，并使用SPSS软件对不同抗生素产生的抑菌圈数据进行方差分析。

A, B. 菌株15 Strain 15；C, D. 菌株17 Strain 17；E, F. 菌株22.1 Strain 22.1；G, H. 菌株26.2 Strain 26.2；I, J. 菌株33 Strain 33；K, L. 菌株37.2 Strain 37.2；M, N. 菌株40.1 Strain 40.1；O, P. 菌株44.2 Strain 44.2；Q, R. 菌株52.1 Strain 52.1；S, T. 菌株125.2 Strain 125.2；U, V. 菌株126 Strain 126
图1 所选11个代表性细菌菌株的形态
Fig.1 Morphology of selected eleven representative bacterial strains

2 结果与分析

2.1 污染细菌的鉴定

共纯化得到52株细菌纯菌株，其中33个菌株为革兰氏阳性，19个菌株为革兰氏阴性。共选取11个代表性菌株(图1)进行16S rDNA序列的测定和分析，以Erwiniaamylovora(NR 102779)为外群，构建最大简约(MP)系统发育树，如图2。

所选11个代表性细菌菌株用粗体标示，标尺指示10步变化 The eleven representative bacterial strains selected in this study were shown in bold, and the scale bar shows 10 changes
图2 所选代表性细菌菌株基于16S rDNA序列构建的最大简约系统发育树
Fig.2 The most parsimonious tree based on 16S rDNA sequences of selected representative bacterial strains

由图2可知，所选11个代表性细菌菌株分别聚在不同的分支中。菌株125.2与草药菌属的一个种Herbiconiuxflava(NR 113225)以78%的支持率聚在一起；菌株40.1与微杆菌属Microbacterium的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株44.1和52.1与短小杆菌属Curtobacterium的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株17和26.2与考克氏菌属Kocuria的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株33与葡萄球菌属Staphylococcus的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株15与芽孢杆菌属Bacillus的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株37.2与鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas的菌株以100%的支持率聚为一个分支；菌株22.1与甲基杆菌属Methylobacterium的菌株以65%的支持率聚在一起；菌株126与Aureimonas的菌株以100%的支持率聚为一个分支。

由以上结果可知，除菌株125.2与菌株22.1尚不能根据序列分析结果准确归属外，其余9个菌株与相应属的聚类支持率均达到100%，可以确定到属。

2.2 抗生素的筛选

采用滤纸片法测定9种抗生素对供试52株细菌纯菌株的抑菌作用(图3)。9种抗生素对供试细菌菌株的抑菌率见表2，抑菌率=抑制的细菌菌株数/供试细菌菌株数×100%。

上排从左至右分别为金霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素，下排从左至右分别为新霉素、青霉素、萘啶酮酸、氯霉素和CK The top row shows antibacterial effect of aureomycin, streptomycin, kanamycin, tetracycline, and gentamicin from left to right,the bottom row shows antibacterial effect of neomycin, penicillin, nalidixic acid, chloramphenicol and CK from left to right
图3 滤纸片法测定抗生素的抑菌效果(供试细菌菌株44.2)
Fig.3 The antibacterial effect of tested antibiotics using filter paper disk method (tested bacterial strain 44.2)

由表1可知，不同抗生素对所得污染细菌的抑制效果存在差异。卡那霉素和庆大霉素对所有供试细菌菌株都有抑制作用。链霉素和新霉素对供试细菌菌株的抑菌作用次之，分别能够抑制98.08%和96.15%细菌菌株的生长；但对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果不尽相同，对所有的革兰氏阴性菌株都有抑制效果，但对革兰氏阳性菌株的抑菌效果稍差，分别能够抑制96.97%和93.94%的革兰氏阳性菌株。金霉素能够抑制90.38%供试细菌菌株的生长，对革兰氏阳性菌株和阴性菌株的抑菌率分别为90.91%和89.47%，相差不大。四环素的抑菌效果较差，对42.31%的供试菌株有抑制效果，且对革兰氏阳性菌株的抑菌效果优于革兰氏阴性菌株，对革兰氏阳性和阴性菌株的抑菌率分别为51.52%和26.32%。萘啶酮酸和青霉素仅对15.15%的供试细菌菌株有抑制作用，且仅对革兰氏阳性菌有抑制效果，对革兰氏阴性菌无作用。氯霉素则对所有的供试细菌菌株都没有抑制作用。由以上结果可知，对煤污病菌分离中污染细菌抑制效果最好的是卡那霉素和庆大霉素，其次是链霉素、新霉素和金霉素。

9种抗生素对供试细菌菌株的平均抑菌圈及其方差分析结果亦见表1。由表1可知，不同抗生素产生的抑菌圈大小也有差异。总体而言，抑菌效果较好的卡那霉素、庆大霉素、链霉素、新霉素和金霉素产生的抑菌圈也较大，在0.01的水平上极显著大于四环素、萘啶酮酸、青霉素和氯霉素等抑菌效果较差的抗生素。链霉素产生的抑菌圈最大，为9.9 mm；卡那霉素和庆大霉素产生的抑菌圈分别为8.2 mm和7.9 mm，且二者无显著性差异。新霉素产生的抑菌圈为5.7 mm，显著小于金霉素产生的抑菌圈(7.0 mm)。

表1 供试9种抗生素的抑菌范围及抑菌圈均值方差分析Table 1 Antibacterial range of tested nine abtibiotics and the variance analysis of inhibition zones

注：对抑菌圈平均直径的差异显著性分析采用Duncan’s新复极差法，不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同列数据差异极显著(P<0.01)。
Note: The variance analysis of inhibition zones was performed using Duncan’s new multiple range method. Different small letters indicated significant differences (P<0.05) of data within the same column, and different capital letters indicated very significant differences (P<0.01) of data within the same column.

3 讨 论

虽然已有研究指出苹果果实表面的细菌数目很多[13]，但并不清楚具体的细菌组成。本研究首次明确苹果果实表面的细菌组成非常复杂，至少包括微杆菌属Microbacterium、短小杆菌属Curtobacterium、考克氏菌属Kocuria、葡萄球菌属Staphylococcus、芽孢杆菌属Bacillus、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Aureimonas等7属的成员，以及2个未确定属，这2个属分别与草药菌属Herbiconiux和甲基杆菌属Methylobacterium比较相近。毫无疑问，上述各属只是苹果果实表面众多细菌中的一小部分，对更多细菌菌株进行研究和鉴定，还会发现更丰富的细菌组成。苹果果实表面细菌组成的复杂性，也是导致煤污病菌分离中很难有效抑制细菌污染的重要原因。

在培养基中添加抗生素是真菌培养和植物组织培养中抑制细菌污染的常用方法[5,14]，但有关不同抗生素对真菌培养中污染细菌抑制效果的研究比较少，植物组织培养中抗生素的抑菌效果研究比较多。在植物组织培养中，不同抗生素的抑菌效果随植物、污染细菌的不同变化较大[8]，本研究的结果表明，不同抗生素对煤污病菌分离中伴随的污染细菌的抑制效果也存在较大差异。

在供试的9种抗生素中，对煤污病菌分离中污染细菌抑制效果最好的是卡那霉素和庆大霉素，这2种抗生素对所有的供试细菌都有抑制作用。卡那霉素在植物组织培养中也能有效抑制细菌污染，在芦笋的组织培养中使用60 mL/L的卡那霉素，组培苗的细菌污染率只有11.1%[15]；而在马铃薯脱毒试管苗的培养中使用10～100 mg/L 的卡那霉素，抑菌率均达100%[16]。周俊辉等[17]报道庆大霉素对植物组织培养中污染细菌的抑制效果优于氯霉素、青霉素和四环素。链霉素、新霉素和金霉素对煤污病菌分离中污染细菌的抑制效果也较好，分别对98.08%、96.15%和90.38%的供试细菌有抑制作用。链霉素在植物组织培养中也有使用，但抑菌效果随植物的不同差异较大。在长春蔓的组织培养中，链霉素对污染细菌的抑制率达98%[18]；但在芦笋组培和马铃薯脱毒试管苗的培养中链霉素对污染细菌的抑制率都只在80%左右[15-16]。新霉素和金霉素则未见相关报道。

本研究中四环素对供试细菌菌株的抑制效果较差，只能抑制42.31%的污染细菌菌株。在植物组织培养中四环素则对污染细菌没有任何抑制作用[17]，这可能与四环素对光敏感、光照下易失去活性有关[8]。本试验中青霉素对煤污病菌分离培养中的污染细菌基本没有抑制作用，这与植物组织培养中青霉素对污染细菌的抑制效果不同。在西瓜[6]、月季[19]、枸杞[20]等植物的组织培养以及马铃薯脱毒试管苗的培养中[16]，青霉素对污染细菌的抑制率均达100%，但使用的质量浓度不同，分别为50 mg/L[6]、40 mg/L[19]、480 mg/L[20]和10～100 mg/L[16]，然而在红掌的组织培养中使用300 mg/L的青霉素抑菌效果只有50%[21]。本研究中氯霉素对供试细菌无抑制作用；在植物的组织培养中，氯霉素对污染细菌有一定的抑制作用，但效果较庆大霉素和青霉素差[17]，在灵芝、平菇、蛹虫草、猴头菇等大型真菌菌株的培养中氯霉素也不能抑制细菌增殖和生长[22]，说明在真菌培养和植物组织培养中氯霉素都不能有效地抑制细菌污染。

本试验所选用的9种抗生素都属于广谱抗生素，但不同抗生素所属类别不同。其中，氯霉素属于氯霉素类抗生素，青霉素属于β-内酰胺类抗生素，萘啶酮酸为氟喹诺酮类抗生素，这些抗生素对煤污病菌分离中的污染细菌没有抑制作用或抑菌效果很差；四环素和金霉素同属于四环素类抗生素，但四环素比金霉素的抑菌效果差，这可能与四环素见光易丧失活性有关；本试验中抑菌效果较好的新霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素都属于氨基糖苷类抗生素。因此，笔者推测氨基糖苷类抗生素对煤污病菌分离中污染细菌的抑制效果最好，其他氨基糖苷类抗生素也可用于抑制细菌污染，四环素类抗生素中除四环素外的其他抗生素也可能有较好的抑制细菌污染的作用。

长时间使用单一的抗生素，很容易导致细菌产生抗药性[8]。因此，在煤污病菌以及真菌的培养中，可交替使用卡那霉素、庆大霉素、链霉素、新霉素、金霉素等，或者是本试验中未使用的其他氨基糖苷类抗生素和四环素类抗生素，以提高抗生素的使用效果。有研究指出，同时使用两种抗生素，能够更好地抑制细菌污染，提高抗生素的抑菌作用[18]。本研究比较了单一抗生素的抑菌效果，不同抗生素复合使用对煤污病菌分离中污染细菌的抑制效果还需要进一步验证。

4 结 论

煤污病菌分离过程中伴随的污染细菌复杂多样，至少包括微杆菌属Microbacterium、短小杆菌属Curtobacterium、考克氏菌属Kocuria、葡萄球菌属Staphylococcus、芽孢杆菌属Bacillus、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Aureimonasi等7属以及2个未确定属；庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素和金霉素等5种抗生素对供试细菌菌株的抑菌效果较好，分别能够抑制100%、100%、98.08%、96.15%和90.38%供试细菌菌株的生长，因此在煤污病菌的分离培养中可以使用这5种抗生素用来抑制细菌污染。

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(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Identification of Bacteria Accompanied with Sooty Blotch and Flyspeck Fungi Isolation and Screening of Antibiotics.

LI Huanyu, LI Zhang, XIN Yueshan and XU Bingliang.

(College of Plant Protection, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

To understand this bacterial group and screen effective antibiotics, this experiment purified bacterial strains accompanied with sooty blotch and flyspeck fungi isolation, identified representative bacterial strains using 16S rDNA sequence analysis, and compared antibacterial effect of nine antibiotics using filter paper disk method. The results showed that bacteria accompanied with sooty blotch and flyspeck fungi isolation was very diverse, including at least nine genera:Microbacterium,Curtobacterium,Kocuria,Staphylococcus,Bacillus,Sphingomonas,Aureimonasi, and two genera close toHerbiconiuxandMethylobacterium,respectively. Antibacterial effect of nine antibiotics varied considerably. Gentamicin and kanamycin inhibited all tested bacterial strains. Streptomycin, neomycin and aureomycin inhibited 98.08%, 96.15% and 90.38% tested bacterial strains, respectively. Tetracycline, nlidixic acid and penicillin only inhibited 42.31%, 9.62% and 9.62% tested bacterial strains, respectively. Chloramphenicol did not inhibit any tested bacterial strains. Therefore, gentamicin, kanamycin, streptomycin, neomycin and aureomycin can be used to inhibit bacterial contamination in isolation of sooty blotch and flyspeck fungi. The results were valuable for eliminating bacterial contamination effectively when isolating and cultivating sooty blotch and flyspeck fungi, as well as other fungi.

Sooty blotch and flyspeck fungi; Bacterial contamination; Antibiotics

2016-06-22 Returned 2016-09-09

The National Natural Science Foundation of China (No.31300024);the “Fuxi Talent Project” of Gansu Agricultural University (No.FXYC20130104).

LI Huanyu,female,lecture.Research area:plant pathogenic fungi.E-mail:648372453@qq.com

XU Bingliang,female,professor.Research area:plant disease integrated management.E-mail:xubl@gsau.edu.com

日期：2017-06-29

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.034.html

2016-06-22

2016-09-09

国家自然科学基金(31300024)；甘肃农业大学“伏羲人才计划”(FXYC20130104)。

李焕宇，女，讲师，研究方向为植物病原真菌学。E-mail：648372453@qq.com 通信作者：徐秉良，女，教授，研究方向为植物病害综合治理。E-mail：xubl@gsau.edu.com

Q93-33

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1004-1389(2017)07-1077-08