建立捻转血矛线虫单虫种分离株的方法

王逢会，王波波，蔡葵蒸

(1．延安大学 医学院，陕西延安 716000；2．西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730030)



建立捻转血矛线虫单虫种分离株的方法

王逢会1，王波波2，蔡葵蒸2

(1．延安大学 医学院，陕西延安 716000；2．西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730030)

为获得捻转血矛线虫单虫种感染性三期幼虫(L3)，以尾鞘长、尾鞘末端尾丝有无和尾丝长占尾鞘长的比例为依据，从自然混合感染有捻转血矛线虫的绵羊粪便中培养并分离该种线虫的L3，然后用6 000条分离的L3经口灌服3～4月龄绵羊。结果显示，绵羊感染后17 d从粪便中检出虫卵，105 dEPG(每克粪便虫卵数)达4 410，至168 d下降为2 010；人工感染10个月后将绵羊剖杀，从其皱胃中收集到捻转血矛线虫成虫2 261条。经鉴定，从人工感染绵羊的粪便中培养和分离出的L3符合捻转血矛线虫L3的特征。

捻转血矛线虫；感染性幼虫；绵羊；人工感染

毛圆科线虫(Trichostrongylidae)病是危害养羊业的主要寄生虫病，特别以捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)病为代表，无论是在热带、亚热带、温带还是寒冷的高原地区均普遍发生,对全世界的畜牧业生产危害严重[1]。为控制该病，过去几十年来频繁使用驱虫药，导致捻转血矛线虫对苯并咪唑(Benzimidazole)、阿维菌素(Abamectin)、左旋咪唑(Levamisole)三大类驱虫药均产生抗药性[2-4]。随着对该线虫抗药性、功能基因及生物防治等研究的不断深入，需要建立单一虫种的感染模式，以保证试验数据的可靠性[5]。目前，建立捻转血矛线虫单一虫种感染的方法[6-7]首先是寻找自然感染该线虫的羊只剖检，取出其真胃(皱胃)，再从胃内容物和胃黏膜中收集成虫，形态鉴定后挑取雌虫作为试验材料，压碎雌虫释放出虫卵或反复从雌虫子宫内冲洗获得虫卵，收集虫卵培养获得纯净的L3，L3经人工感染羊只后，在羊体内成熟、繁殖以供试验之用。上述方法需要大量的雌虫，但该虫种感染生产中屠宰羊只的强度不高，需要屠宰较多的羊才能获得足够的虫卵，这样不仅增加收集成本，而且由于雌虫子宫内的虫卵很大一部分未成熟，导致孵化率较低。本研究拟采用简化的感染性幼虫识别方法，从自然混合感染捻转血矛线虫的绵羊粪便中培养分离获得该种线虫的L3，人工感染绵羊来建立单虫种的动物感染模式。

1 材料与方法

1.1 粪便来源

参照流行病学调查结果，甘肃榆中县夏官营地区的绵羊混合感染捻转血矛线虫、蛇形毛圆线虫、细颈线虫等，其中捻转血矛线虫为优势虫种，收集该地区经虫卵检查阳性的绵羊粪便，备用。

1.2 试验动物

3～4月龄、体质量15 kg左右的健康绵羊1只，购于榆中县夏官营某养殖户，用丙硫咪唑(15 mg/kg)和左旋咪唑(10 mg/kg)联合驱虫。试验羊饲养于隔离房间，饲喂洁净的干草，补饲麸皮和玉米，自由饮水，驱虫1周后，经粪便虫卵检查无虫卵后备用。

1.3 L3的分离培养

按照Wang等[8]的方法，将“1.1”中收集的新鲜绵羊粪便在托盘中搓碎，盛于医用搪瓷盒中，粪便约占搪瓷盒体积的2/3，喷水加湿至粪便用手捏略有水渗出为宜，加盖后置于28 ℃培养箱中培养。每天或隔天检查并搅拌粪便，如盒盖上无水滴，补喷水分至适当的湿度并搅拌均匀。连续培养7 d后，将粪便堆成圆锥状并使堆顶与盒盖接触，次日用蒸馏水将爬到盒盖上的L3冲入烧杯中，然后翻搅粪便并根据具体情况补充水分，将粪便重新堆积，加盖继续培养。连续3 d冲洗盒盖上的L3于烧杯中，备用。

1.4 从L3混悬液中分离捻转血矛线虫L3

参考Van Wyk等[9]采用的牛羊线虫L3形态学鉴定方法，以尾鞘长、尾鞘末端尾丝有无和尾丝长与尾鞘长的比例为依据，从“1.3”获得的L3混悬液中分离捻转血矛线虫L3。捻转血矛线虫L3的尾鞘末端有尾丝，尾丝长占尾鞘长的10%～16%(图1)。取“1.3”获得的L3混悬液适量于直径8 cm的平皿中，用4 ℃冷却的蒸馏水调节至幼虫适合挑出的浓度。将平皿置于倒置显微镜(Olympus,IX2-SLP,Japan)下，用特制的玻璃毛细吸管于4×物镜下将符合捻转血矛线虫L3特征的幼虫挑出，放入新的平皿中。初次挑虫时，可将挑出的幼虫先置于载玻片上，加1滴稀碘液使幼虫停止活动或死亡变直，加盖玻片用显微镜测微尺测量虫体长度、尾鞘长度，观察头端形状和肠细胞数量，确定符合捻转血矛线虫L3特征并积累经验后，再从混合幼虫悬液中挑出所要的L3，直至达到所需数量。接种动物前再在倒置显微镜下核查1次，剔除个别不具特征性的L3。

A.总长 Total length；B.幼虫尾端 Tip of larval tail；C.尾鞘 Sheath tail；D.尾丝 Filament

1.5 试验动物的人工感染

将“1.4”中分离的L3混合均匀，取20 μL加载玻片上于显微镜下计数，根据计数结果计算每毫升原虫液中所含的幼虫数。用注射器改造的自制灌药装置，参考Waghorn等[10]所报道的剂量，给试验羊经口灌服6 000条L3，隔离饲养17 d后，从直肠取新鲜粪便，用麦克马斯特氏法(McMaster)统计EPG，以后每隔一段时间进行粪便虫卵计数，每次计数重复3次，取平均值，以感染时间为横坐标，每克粪便平均虫卵数为纵坐标在Excel中作图。同时收集部分粪便样品按“1.3”方法进行L3的培养与鉴定。

1.6 人工感染羊剖检和目的虫种鉴定

“1.5”中的感染羊只隔离饲养10个月后，采用畜禽全身寄生虫学剖检法检查体内虫体[11]，并对收集到的成虫进行虫种鉴定，以确定是否为单虫种感染。

2 结果与分析

2.1 人工感染绵羊粪便中虫卵检测

用分离的L3感染试验羊后，于接种后第17 天从粪便中检查到少量虫卵，粪便中虫卵量随感染时间增加快速上升，第105 天时排出虫卵量达峰值(平均4 410)，此后缓慢下降，至第168 天平均为2 010(图2)。

图2 人工感染绵羊粪便的虫卵量Fig.2 Dynamic changes of eggs in feces from artificially infected sheep

2.2 人工感染绵羊粪便中L3的特征

感染绵羊后，经粪便培养收集到形态一致的L3(图3-A、3-E)，幼虫头端在口腔和食道之间没有横带(图3-B)，尾端有尾鞘、至尖端渐细、末端有尾丝(图3-C)，幼虫小肠细胞为16～18个，幼虫体长、食道长和尾鞘等的测量结果见表1。从表1可知，从人工感染绵羊粪便中分离培养的L3符合捻转血矛线虫L3的特征。

A.杀死后的幼虫 Killed larva； B.幼虫的头端 The cranial extremity of larva；C.幼虫尾部 The tail of larva；D.虫卵 Eggs；E.活动时的幼虫 Living larva
图3 人工感染绵羊粪便中分离培养的虫卵和L3
Fig.3 The eggs and the L3 in feces from artificially infected sheep and adult in its body

表1 人工感染绵羊粪便分离培养的L3性状Table 1 Measurements of infective L3 cultured from feces of artificially infected sheep μm

2.3 人工感染绵羊体内成虫的收集和鉴定

人工感染羊感染10个月后剖杀，从其皱胃中收集到成虫2 261条，回收率37.7% (2 261/6 000)，经虫种鉴定均符合捻转血矛线虫雌、雄虫特征，在感染羊其他内脏器官中均未发现有虫体寄生。

3 讨 论

采用简化的L3鉴别技术，从自然感染捻转血矛线虫的羊群中采集新鲜粪便，培养并分离出捻转血矛线虫L3，用获得的L3接种3～4月龄羔羊后，于不同时间段检查粪便中的虫卵。结果表明，感染17 d后从粪便中排出虫卵，至105 d达到高峰。从人工感染羊的粪便中培养分离得到的捻转血矛线虫L3形态一致，符合捻转血矛线虫L3的特征[6]。试验羊感染10个月后采用畜禽全身寄生虫学剖检法，从其皱胃中回收到该种成虫，并无其他虫体寄生，证明本法所分离和接种的L3属于捻转血矛线虫，也说明本研究采用的建立捻转血矛线虫单虫种感染的方法是可行的。此外，由于节约前期收集成虫所需成本，因而更适合于在生产中应用。

捻转血矛线虫是最常见的胃肠线虫，根据笔者的实践经验，只要粪便检查中能够查出虫卵，且每克粪便中的虫卵数在100以上，就能够在粪便培养中收集到相当数量的捻转血矛线虫L3，因而采用本法获取捻转血矛线虫L3并不困难。捻转血矛线虫L3尾鞘较长，为蛇形毛圆线虫(Trichostrongyluscolubriformis) 尾鞘的2.6倍左右[9]，尾部具有尾丝，尾丝占尾鞘长的10%～16%，而后者无尾丝，因此当二者混合感染时很容易区别。与以往报道[12]的采用观察头部结构、计数肠细胞数量、测量虫体大小等方法鉴别粪便中的L3相比，本研究采用的鉴别L3的方法省去逐条测量的麻烦，而是在倒置显微镜视野中根据尾丝的有无及估测尾丝占尾鞘的比例就可以从L3混悬液中鉴别分离捻转血矛线虫L3。然而，对于初学者来说，在实际工作中需要一定的培训才可以做到。可以事先抽取疑似该种线虫的L3在显微镜下测量其尾鞘、尾丝的长度，根据资料对比是否符合目的L3的特征，然后在倒置显微镜下观察幼虫活动和尾部特征，反复训练即可在1 d内掌握该项技术。另外，在挑取幼虫过程中由于捻转血矛线虫L3在温度较高时运动性较强，有时不易挑取和辨认。为解决这一问题，将L3混悬液在 4 ℃冰箱中冷却使其活动减慢或静止，这样更容易辨认和挑取捻转血矛线虫L3。

Reference：

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

A Simple Method to Establish a Monospecific Isolate ofHaemonchusContortus.

WANG Fenghui1,WANG Bobo2and CAI Kuizheng2.

(1.Medical College of Yan’an University,Yan’an Shaanxi 716000,China; 2.College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

To obtain infective third-stage larvae (L3) of a monospecificHaemonchuscontortus, based on the length of the sheath tail,the presence or absence of filament at the end of the sheath tail and the proportion of the sheath tail comprised of filamen,L3 larvae ofHaemonchuscontortuswere cultured and isolated from the feces of sheep infected with natural mixed nematodes. Then three to four month-old lamb was administered orally with the 6 000 L3 larvae isolated. The results showed that eggs were detected in the feces of the tested sheep at 17 days after infection. The amount of eggs excreted reached to 4 410 eggs per gram (EPG) of feces at 105 days after infection,then it declined to 2 010 EPG at 168 days. On 10 months post infection the sheep was killed and 2 261 adult worms ofH.contortuswere collected from sheep’s abomasum. The L3 larvae cultured and isolated from feces of artificially infected sheep were matched the characteristics of L3 larvae ofH.contortusby morphological identification.

Haemonchuscontortus; Infective larvae; Sheep; Artificial infection

2016-04-15 Returned 2016-05-30

Changjiang Scholars and Innovative Research Team University (No.IRT13091).

WANG Fenghui,female,master,lecturer.Research area:parasitebiology.E-mail:xsybz930612@126.com

CAI Kuizheng,male,Ph.D,professor.Research area:systematics and bio-control of animal parasite. E-mail:ckz000@126.com

日期：2017-06-29

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.036.html

2016-04-15

2016-05-30

教育部“长江学者和创新团队发展计划”(IRT13091)。

王逢会，女，硕士，讲师，研究方向为寄生虫生物学。E-mail:xsybz930612@126.com 通信作者：蔡葵蒸，男，博士，教授， 研究方向为动物寄生虫系统分类学和生物防治。E-mail:ckz000@126.com

S855.9

A

1004-1389(2017)07-1085-05