新疆南疆驴源H3N8亚型EIV HA基因序列分析

刘永宏，李 飞，张路瑶，赵 丽

(塔里木大学 动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

新疆南疆驴源H3N8亚型EIVHA基因序列分析

刘永宏，李 飞，张路瑶，赵 丽

(塔里木大学 动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

为明确新疆南疆驴是否感染马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驴源EIVHA基因特征，根据GenBank登录的EIV基因序列，设计合成1 对引物，采集新疆南疆地区2 个驴屠宰点33 份驴肺组织样品，采用RT-PCR扩增驴源EIVHA基因片段，并对扩增产物进行测序与序列分析。结果表明，中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因长1 704 bp，编码567 个氨基酸。同源性分析结果显示，与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.9%～99.9%和88.3%～99.8%，与国内毒株和哈萨克斯坦毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一1 个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比对结果显示，2 个毒株裂解位点、糖基化位点、抗原位点和受体结合位点氨基酸完全一致，只是错位2 个氨基酸。确定新疆南疆存在驴感染EIV，可能为国内疫情的延续或周边国家传入。

新疆南疆；驴；马流感病毒；H3N8亚型

马流行性感冒，简称马流感(Equine influenza,EI)，是由马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)引起马、驴和骡的一种高度接触性呼吸道传染病[1-2]，现在发现该病毒还感染犬和猪[3-4]。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物传染病，中国将其列为三类动物疫病[5]。马流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒属(Influenza virus A)。目前，A型流感病毒根据血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原不同可以分为不同的亚型，H1～H16 16 个亚型和N1～N9 9 个亚型。从系统发育生物学角度分别对HA基因和NA基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行分析，所获结果也为上述分类提供佐证[6]。EIV有 2 个亚型，分别是H7N7亚型EIV(马甲1型)和H3N8亚型EIV(马甲2型)[1，7-8]。马流感的频繁暴发对养马业尤其赛马业危害极其严重，已在世界范围内造成巨大的经济损失。

中国历史上至少发生过 4 次马流感大流行，即1974 年由H7N7亚型EIV引起的首次大流行，疫情首先从新疆开始，然后向南向东传播蔓延至 17 个省(市)、自治区，自此之后H7N7亚型EIV在中国马群中再未分离到；1989-1990 年，在吉林、黑龙江和内蒙古连续 2 次暴发马流感疫情；1992-1994 年，在中国西部、西北、华北和西南等地区马群中暴发马流感疫情；2007年，新疆、甘肃省相继暴发马流感疫情，并迅速蔓延传播到华北地区。后3 次马流感疫情均由H3N8亚型EIV引起[9]。

目前，新疆及新疆周边邻国存在马流感疫情[10-12]，这对新疆地区马属动物的威胁十分严重。此外，考虑新疆南疆特殊的气候环境和地域地貌特点，有必要研究这个曾经的疫区当前是否存在EIV以及EIV毒株的特征。本研究对采集自新疆南疆的驴肺组织样品进行EIV核酸检测，并对HA基因进行序列分析。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 组织样品 33 份驴肺组织样品，2015年采自新疆南疆地区2 个驴屠宰点，-20 ℃保存，备用。

1.1.2 主要试剂 Trizol invitrogenTM(Code No.15596-026)，购自Invitrogen生物工程有限公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)，PremixTaq○RVersion2.0(Code No.R004A)，DL2000 DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit(Code No.DP209)，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物设计与合成 利用Primer Premier 5.0，以GenBank数据库中国内外已发表的保守的马属动物H3N8亚型EIV和H7N7亚型EIV的HA基因全序列为参照设计1 对特异性引物。上游引物HA1为5′-AGCAAAAGCAGGGGATATT-3′，下游引物HA2为5′-AGTAG- AAACAAGGGTGTTTT-3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，预期扩增产物大小约为1.8 kb。

1.1.4 参考毒株 国内外不同地区不同时间的53 个EIVHA基因全序列，均来源于GenBank数据库，毒株详细信息见表1。

表1 参考毒株Table 1 Reference isolates

(续表1 Continued table 1)

1.1.5 主要仪器 PCR仪(TC-5000,Bibby scientific Ltd)，小型高速冷冻离心机(R134a,Hermetically sealed refigeration system)，电泳仪(DYY-12，北京市六一仪器厂)，紫外分析仪(JY02S,北京君意东方电泳仪设备有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取 按Trizol invitrogenTM试剂盒操作说明从驴肺组织样品中提取总RNA。

1.2.2 RT-PCR反应 以提取的总RNA为模板，利用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒和合成的HA基因特异性引物，采用一步法扩增HA基因片段，退火温度为53 ℃。

1.2.3 PCR产物纯化回收 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，按照TIANgel Midi Purification Kit试剂盒说明进行目的片段回收纯化。

1.2.4 测序 将纯化的目的片段标记后送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.5 序列分析 测序结果与表1中不同地区不同时间来源的53 个EIVHA基因全序列用DNAStar软件EditSeq程序将其核苷酸和氨基酸序列分别保存为*.Seq和*.Pro格式文件，应用该软件MegAlign程序Clustal W法进行比对，然后在Veiw菜单中Sequence Distance和Phylogenetic Tree提取序列比对结果和进化树图。同时结合毒株时空分布分析中国新疆南疆地区驴源EIV来源及演变特征。

2 结果与分析

2.1 驴源EIVHA基因片段RT-PCR扩增

RT-PCR扩增结果显示，33 份样品中有2 份样品为阳性，目的片段大小约1.8 kb，与预期一致，阴性对照成立(图1)。

M.Maker；1.阴性对照 Negative control；2～3.HA基因 HA gene

2.2 中国新疆南疆驴源EIVHA基因核苷酸序列分析

对扩增的HA基因片段测序，并将测序结果与GenBank中部分EIVHA基因序列进行比对，结果发现，中国新疆南疆驴源EIV为H3N8亚型，命名为A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)，其HA基因包括1 个完整阅读框，长1 704 bp，与GenBank数据库中唯一1 个驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)HA基因的核苷酸同源性为99.6%；与2007年中国广西EIV毒株A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)HA基因的核苷酸同源性最高，为99.7%；与1994年中国青海EIV毒株A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)HA基因的核苷酸同源性最低，为95.1%；与国外的毒株相比，核苷酸同源性最高的为2007年来源于哈萨克斯坦的毒株A/equine/Otar/764/2007(H3N8)，同源性达99.9%；最低的为来源于阿尔及利亚的毒株A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)，同源性仅88.9%。与H7N7亚型EIV毒株核苷酸同源性变幅为58.2%～58.9%。

根据HA基因核苷酸序列绘制的进化树显示(图2)，囊括来源于28 个国家的54 个EIV毒株被划分为2个大的分支，1个分支为H3N8亚型EIV毒株，另1个分支为H7N7亚型EIV毒株，A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)被划分在H3N8亚型分支，该毒株与2007年新疆的1 个马源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)和1 个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)，以及2009年1 个来源于印度的毒株A/equine/Ahmedabad/1/2009(H3N8)在1 个小的进化分支内；其次，与2008年中国广西的A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株、2007年哈萨克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株和2010年中国黑龙江的A/equine/Heilongjiang/1/2010(H3N8)株进化关系也非常近。

2.3 中国新疆南疆驴源EIVHA基因编码氨基酸序列分析

中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA基因编码567 个氨基酸，与A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的HA氨基酸同源性为 98.2%；与国内毒株氨基酸同源性最高的为2010年中国黑龙江的A/equine/Heilongjiang/1/2010(H3N8)株，同源性为99.1%；与中国毒株氨基酸同源性最低的为1994年中国青海的A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)株，同源性仅94.2%。与国外毒株相比，氨基酸同源性最高的为2007年哈萨克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株，同源性达99.8%；与H3N8亚型EIV毒株氨基酸同源性最低的为日本的A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)株，同源性为88.3%。与H7N7亚型EIV毒株氨基酸同源性变幅为45.3%～46.2%。

2.3.1 HA裂解位点处序列分析 中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA裂解位点处(HA1与HA2之间连接肽)的序列为-PEKQIRG↓IF-，与A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的一致。其他毒株为-PE/G(A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8))K(H3N8)/R(H7N7)R(A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)和A/equine/Algiers/1/1972(H3N8))/Q(其余H3N8)/K(H7N7)/L(A/equine/Sao Paulo/1/1969(H3N8)、A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)和A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8))/I(其余H3N8)K(H7N7)RG↓I(H3N8)/L(H7N7)F-。H7N7亚型EIV在-PE│KQ-处插入(│插入位点)11 个氨基酸。

2.3.2 HA糖基化位点分析 中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA氨基酸序列含有8 个糖基化位点，分别位于N25NT、N39GT、N55AT、N70NS、N80CT、N182VT、N302GS和N500GT位，与毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位点分布个数相同，但错位2 个氨基酸。

2.3.3 HA抗原位点分析 中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA上有A、B、C、D和E 5 个抗原位点，位点A由140～146 位的EGFTWTG氨基酸残基和133～137 位GTLEF氨基酸残基组成，位点B由156～160 位CKRGS氨基酸残基和187～198 位NNKNFDKLYIWG氨基酸残基组成；位点C为V53、T54、F275和K278位氨基酸残基组成；位点D由E207和L171位氨基酸残基组成；位点E为I63、G78、C81和L83位氨基酸残基组成。与毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)抗原位点氨基酸完全一致，只是错位2 个氨基酸。

2.3.4 HA受体结合位点(RBS)分析 中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)HA的受体结合位点为Y98、E136、F137、T143、S153、A155、V183、P186、N190、K193、L194、Y195、I196、W197、S216、S226、Q227和Q228，与毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)受体结合位点处氨基酸一致，也错位2 个氨基酸。

图2 马流感病毒毒株HA基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene of EIV isolated

3 讨 论

通过对新疆南疆驴肺组织样品进行EIV核酸检测及HA序列分析，证实目前中国新疆南疆驴体内存在H3N8亚型EIV。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)与中国新疆2007年驴源毒株核苷酸同源性为99.6%；与中国EIV毒株核苷酸同源性最高的为2007年中国广西的A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株，达99.7%；与国外毒株核苷酸同源性最高的为2007年哈萨克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株，同源性达99.9%。HA基因核苷酸全序列基因进化树也显示，本研究毒株与2007年新疆1 个马源毒株和1 个驴源毒株，以及2009年1 个印度毒株在一个小的进化分支内。其次，与2008年中国广西株、2007年哈萨克斯坦株和2010年中国黑龙江株关系也非常近。表明新疆南疆驴源毒株可能为早些时间中国EIV毒株的延续或周边国家毒株跨境或季风原因传播扩散的。

HA是一种糖蛋白，是宿主免疫系统的主要靶抗原，可以诱导机体产生中和抗体，发挥免疫保护作用，抵抗流感病毒的感染。HA蛋白的抗原位点易发生变异，并可引起HA抗原漂移。EIV HA主要功能是结合宿主的唾液酸受体，使病毒附着于细胞上，进而穿过宿主细胞膜并改变抗原性及逃避宿主免疫系统的监视等。病毒与宿主细胞有效的结合对于在流行和暴发期间病毒扩散是至关重要的。病毒与宿主细胞受体结合以及病毒与细胞膜的融合都是由HA介导的。因此，HA是病毒毒力和宿主范围的一个重要决定因素[9]。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA的裂解位点处不具有4 个或4 个以上连续的与病毒致病力有关的碱性氨基酸聚集，说明本研究的毒株为低致病性流感病毒。该毒株HA的糖基化位点有6 个，与A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)相比，糖基化位点总数相同，但由于第8位氨基酸后有2 个氨基酸(FI)插入，所以导致本研究的毒株所有糖基化位点位置后移2 位氨基酸。抗原位点和受体结合位点也是同A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)没有任何变化，只是后移2 位氨基酸。

H3N8亚型EIV属于A型流感病毒，可感染多种哺乳动物，并在宿主间广泛传播[13-15]，据报道，H3N8亚型EIV能从马跨越种间障碍传播给狗和猪[3-4]，该特征给流感防制造成一定程度的困难。新疆及新疆周边国家存在马流感疫情，且随着新丝绸之路及国家政策对新疆马业发展的影响，新疆马匹的流动性日益增强、流动范围越来越广，为马流感的传播提供有利条件。希望马业相关单位重视对马属动物马流感疫情及哺乳动物马流感的监测，为马业的健康长期发展提供保障。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Sequence Analysis ofHAGene of H3N8 EIV of Donkey in South Xinjiang

LIU Yonghong,LI Fei,ZHANG Luyao and ZHAO Li

(Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science and Technology of Xinjiang Production & Construction Corps,College of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

In order to clarify whether donkey was infected by EIV in South Xinjiang and the characteristics of HA gene of EIV from donkey,a pair of primers was designed and synthesized according to the sequence of HA gene from GenBank.The HA gene fragment was amplified by RT-PCR for 33 samples of donkey lungs from two donkey slaughter houses in South Xinjiang.Then the electrophoresis analysis, gel recovery,sequencing and sequence analysis were utilized.The results showed that HA gene of A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8) strain was 1 704 bp in length,encoding 567 amino acids.The homology of the nucleotide sequence and the amino acid sequence with H3N8 subtype of EIV reference strains from domestic and foreign was 88.9%-99.9% and 88.3%-99.8%,respectively.The strain,the Chinese strains and Kazakhstan strain were in same evolutionary branching.Amino acids of cleavage site,glycosylation site,glycosylation site and receptor binding site were completely consistent with A/donkey/Xinjiang/5/2007 (H3N8) that the only one strain from donkey in the GenBank database,but two amino acids were misplaced.There were donkeys infected with EIV in South Xinjiang and what may be continuation of the domestic epidemic or introduced from the neighboring countries.

South Xinjiang; Donkey; EIV; H3N8 subtype

LIU Yonghong,male,associate professor.Research area: infectious diseases and immune pathology.E-mail: lyhdky@126.com

ZHAO Li,female,Ph.D,associate professor.Research area: parasitic diseases and immune pathology.E-mail:zhaolidky@126.com

日期：2017-03-03

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.078.html

2016-02-05

2016-03-24

兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(HS2014011)。

刘永宏，男，副教授，研究方向为传染病与免疫病理学。E-mail: lyhdky@126.com

赵 丽，女，博士，副教授，研究方向为寄生虫病与免疫病理学。E-mail: zhaolidky@126.com

S855.3

A

1004-1389(2017)03-0329-07

Received 2016-02-05 Returned 2016-03-24

Foundation item Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science and Technology (No.HS2014011).