加工番茄连作对土壤微生物群落多样性的影响

孙文庆,康亚龙,刘建国,蒋桂英

(石河子大学 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子 832003)



加工番茄连作对土壤微生物群落多样性的影响

孙文庆,康亚龙,刘建国,蒋桂英

(石河子大学 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子 832003)

通过在石河子大学农学院试验站开展加工番茄连作(种植1 a、连作3 a、5 a和 7 a)定点微区试验，于花果期和成熟期采集根际土壤, 利用聚合酶链-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术, 分析不同连作年限加工番茄根际微生物结构和多样性的变化。结果表明， 随着加工番茄连作年限的延长，根际土壤细菌的丰富度和Shannon-Wiener多样性均有所降低，而真菌的丰富度和多样性有所升高，且成熟期>花果期。连作对土壤细菌和真菌的Pielou均匀度指数影响不明显，说明各处理土壤微生物类群分布比较均匀。连作明显改变了土壤中土著细菌的群落结构，一些土著细菌优势种群数量减少或消失；土壤真菌的优势种群随连作年限的变化较大，某些真菌类群大量富集，而另一些真菌数量明显减少，甚至消失，其中，加工番茄连作5年时土壤中新出现的真菌优势种群最多，且与其他真菌种群的数量差异较大。加工番茄连作后土壤细菌和真菌群落结构失衡可能是产生连作障碍问题的重要因素。从条带测序结果看，各连作处理土样中细菌优势种群属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)、节杆菌属(Arthrobacterramosu)、α-变形杆菌(Alphaproteobacterium)、不可培养的α-变形杆菌(UnculturedAlphaproteobacterium)和不可培养细菌(Uncultured bacterium)，真菌优势种群属于不可培养真菌(Uncultured fungus)、Geosmithiaputterillii、 淀粉丝菌(Amylomycesrouxii)、热带念珠菌(Candidatropicalis)和漆斑菌属(Myrotheciumsp)。总之，加工番茄连作导致根际有益菌数量减少而病原菌大量滋生，从而降低了加工番茄抵御病害的能力。

加工番茄；变性梯度凝胶电泳技术；根际土壤；微生物多样性；连作

土壤微生物群落的组成及其多样性是衡量土壤性质和功能的一个重要指标，可直接预警土壤健康受损情况或恢复潜力的灵敏度[1]。连作障碍的成因极其复杂,研究表明：土壤微生物数量和种群构成发生变化是引起连作障碍问题的本质原因，韩剑等[2]、刘军等[3]研究棉花长期连作障碍时发现，连作5 a后，土壤微生物的菌群结构向真菌型过渡，拮抗菌减少，病原菌积累，土壤质量劣化。已有研究表明，植物土传病害的绝大多数是真菌病原体触发，如棉花黄萎病是一种土传真菌病害的典型[4]。作物长期连作后会破坏土壤微生物群落结构和多样性平衡[5-6]。张重义等[7]研究地黄多年连续种植时发现，重茬地黄根际细菌的种类大量减少，是造成根际土壤微生物群落功能紊乱的因素。马云华等[8]发现随着黄瓜连作年限的增加,其根际土壤微生物的总量、细菌和放线菌数均呈倒“马鞍” 型变化，真菌的数量呈线性增长, 微生物由细菌型向真菌型过渡, 其中氨化细菌和尖孢镰刀菌分别为温室黄瓜的连作土壤优势细菌和真菌生理群。生产实践也证明，连作障碍产生的根本原因是微生物种群减少和有害微生物的数量增加。可见，土壤微生物活性转变是产生连作障碍的原因之一。因此，研究土壤微生物群落结构及其多样性和动态性等信息，为深入揭示加工番茄连作障碍形成的分子机制和探索合理有效的消减策略提供一定的理论依据。迄今为止，有关加工番茄连作障碍机理的研究仅限于自毒作用、酶活性、土壤微生物数量等方面。如李志宏[9]研究表明加工番茄根、茎、叶腐解物中的化感物质对加工番茄幼苗的生长、根系活力、根系 SOD及 CAT 活性均有抑制作用，并且随着处理浓度的增加，其抑制作用也随之增强；刘易等[10]发现加工番茄的根系残体浸提液对土壤过氧化氢酶及磷酸酶活性均有激活作用,土壤脲酶活性随着培养时间的延长而逐渐降低；孙艳艳等[11]认为，连作后根际土壤由细菌型向真菌型转化, 反硫化细菌数量随着连作年限的延长而增加, 硝酸细菌以及好氧性自身固氮菌数量呈递减的趋势。刘慧杰等[12]的研究表明利用PCR-DGGE 技术能更客观地反映红树林沉积物中真实的细菌群落结构信息。而关于加工番茄连作土壤根际微生物尤其是未培养微生物连续变化的研究报道较少。PCR-DGGE 技术以土壤微生物总的基因组 DNA 为研究对象，通过比较细菌种群 16S rDNA及真菌28S rDNA 核糖体间隔区的基因信息，有效消除了传统培养中由于培养基的选择性而导致微生物群体多样性丧失等问题[13]。本试验运用聚合酶链-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究了不同种植年限、不同生育阶段加工番茄根际土壤微生物类群的丰度、区系结构和代谢类群多样性的差异及变化趋势，分析和比较了土壤微生物群落结构及其多样性和动态性等信息，以期为深入揭示加工番茄连作障碍形成的分子机制和探索合理有效的消减策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在新疆石河子大学农学院试验站(东经85°59′50″，北纬44°18′58″)的加工番茄长期连作定点微区试验田进行。海拔437～450 m，年日照时数为2 721～2 818 h，无霜期为168～171 d，≥10 ℃的活动积温为3 570～3 729 ℃，年均降水量208 mm，蒸发量1 660 mm。属于典型的大陆性气候，光照充足但干燥少雨，昼夜温差大，适合灌溉农业生产。土壤类型为典型灌耕灰漠土(calcaric fluvisal)，土壤质地为砂壤土。加工番茄4块连作地土壤的基本理化性质见表 1。

表1 加工番茄不同连作年限试验地耕层土壤的基本理化性质Table 1 Physico-chemical properties of tested soil of processing tomatoes under different years of continuous cropping

注：同列中数值后面的不同小写字母表示不同连作处理间差异显著(P<0.05)。
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different continuous cropping years(P<0.05).

1.2 试验设计

2007年在石河子大学农学院试验站选取休闲3 a以上的空地，南北走向，长12 m，宽5 m，面积60 m2。将该空地划分为3个小区，每区面积均20 m2，每个小区做3次重复。同时，开始种植加工番茄，番茄主栽品种‘里格尔87-5’，种植密度为4.8万株·hm-2。采用机采模式，一膜两行直播种植，宽窄行配置80 cm+40 cm，株距35 cm。7～8 d滴水1次，共计12次，生育期内滴水6 250 m3·hm-2。随水滴肥，生育期内滴施纯氮(N)207 kg·hm-2，磷(P2O5)84.86 kg·hm-2，钾(K2O)56.18 kg·hm-2。其他管理同大田生产。自2007年10月到2014年10月加工番茄收获，连续分别形成了种植1 a(CK)、连作1、2、3、4、5、6、7 a 7个加工番茄连作处理。取连作1 a(2014年)、连作3 a(2012年)、5 a(2010年)和7 a(2007年)4个加工番茄根际土壤，分析土壤微生物种群变化。

1.3 供试土壤采集及预处理

在加工番茄连作1 a、3 a、5 a、7 a小区于花果期(FS)和成熟期(MS)按5点取样法分别选取长势均匀的加工番茄植株15株，将其根系区土壤用铁铲挖出，抖掉根系外围土，取紧贴在根表附近的土样，将所得5 个土样制成混合土样，仔细剔除植物残体、石头和其他杂物，混匀后置于无菌袋内带回实验室，过2 mm 土筛后保存于-80 ℃冰箱。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 土壤微生物基因组DNA的提取和纯化 用 PowerSoil○RDNA Isolation kit(t50)试剂盒方法，准确称0.50 g土壤样品，按试剂盒实验程序进行土壤微生物的总DNA提取，于-20 ℃保存。

1.4.2 样品DNA的PCR扩增 选择细菌通用引物 R518/F357-GC，真菌通用引物 NS1/Fung-GC对土壤微生物总DNA进行PCR扩增，引物具体信息如表2所示。在进行变性梯度凝胶电泳时,在引物F357和Fung的5′端分别加GC夹来防止DNA片段过早解链。

细菌PCR扩增参数：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性0.5 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，每个循环加1 s，共30个循环，再于72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。50 μL反应体系：ddH2O 41.25 μL，10×Buffer(含2.0 mmol·L-1MgCl2)5 μL，dNTP(10 μmol·L-1)1 μL，F357-GC(10 mmol·L-1)1 μL，R518(10 mmol·L-1)1 μL，Taq酶(5 U· μL-1)0.25 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR 产物检测：取PCR产物各3 μL，15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120 V稳压电泳30 min，凝胶成像仪拍照,检查扩增效果。

真菌PCR扩增参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后于72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。50 μL反应体系： 10×Buffer(含2.0 mmol·L-1MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，Fung-GC(20 pmol·L-1)1 μL，NS1(20 pmol·L-1)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.4 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至总体积50 μL。PCR 产物检测：取PCR产物各2 μL，15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120 V稳压电泳15 min，用凝胶成像仪拍照,检查扩增效果。

表2 PCR扩增引物的序列Table 2 PCR amplification of sequences of the primers

注：* GC 夹：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC。
Note:*GC clamp:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC.

1.4.3 PCR产物的DGGE分析 分别取细菌V3区和真菌28 S样品各400 ng的PCR产物，选D-Code system(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，USA)对样本进行DGGE分析。具体条件为：(1)细菌：体积分数为80%的聚丙烯酰胺凝胶[m(丙稀酰胺)∶m(双丙稀酰胺)=37.5∶1]，体积分数为30%～60%的变性剂，在60 V电压，60 ℃恒温，1×TAE 缓冲液中电泳16 h。电泳结束后，用ddH2O洗胶，然后将胶放进含EB的染液中，置于摇床上染色30 min后，用Bio-Rad凝胶成像系统拍摄图谱。(2)真菌：质量浓度为80 g·L-1的聚丙烯酰胺凝胶[m(丙稀酰胺)∶m(双丙稀酰胺)=37.5∶1]，体积分数为15%～40%的变性剂，在70 V电压，60 ℃恒温，1×TAE 缓冲液中电泳13 h。电泳结束后，用ddH2O冲洗胶，然后将胶放进含TE的染液中，同细菌。

1.4.4 DGGE图谱优势条带的回收和测序 分别选取经过EB染色和TE染色照相后有代表性的聚丙烯酰胺凝胶，置于紫外灯下，用灭菌的手术刀片，将明亮清晰的目标DGGE条带小心完整地切下，装入1.5 mL离心管中，按SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，SK8131)方法回收，-20 ℃保存备用。

取上述DGGE条带切割后分别放入 EP 管中，用ddH2O多次冲洗，直到无染色剂残留后完全浸于50 μL 去离子水碾碎，4 ℃放置过夜保存，以溶出胶条中的DNA片段。以DNA浸出液为模板，分别用相应的细菌带夹引物F357-GC/R518和真菌带夹引物 NS1/Fung-GC按照前述程序进行PCR扩增。扩增后，用DGGE对扩增产物片段进行验证，判断是否与所回收条带的电泳行为相一致，待确定回收条带的正确位置后，将纯化后的PCR产物与pMD○R18-T载体连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，送上海生工生物工程股份有限公司纯化测序。

2 结果与分析

2.1 加工番茄连作土壤中微生物基因组 DNA 的提取及PCR扩增

由图1可见，加工番茄连作处理花果期和成熟期土壤样品中所提取出的 DNA 片段大小相近且均约为 23 kb，条带表现出较好的纯度和完整性，可用于PCR 扩增的模板用。进一步观察分析发现，加工番茄花果期和成熟期，不同连作年限处理下条带亮度存在差异，可能是不同处理样品中所含的微生物数量不同所致。

如图2所示，用质量浓度为15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增结果进行检测，发现加工番茄不同生育时期不同连作年限处理下细菌16S rDNA和真菌28S rDNA扩增条带的亮度和纯度都比较好，无非特异性扩增现象。进一步分析可知，扩增产物的大小与目的片段相近，分别约为260 bp和400 bp。可见，PCR的扩增效果良好，可进行扩增产物DGGE 试验。

F.花果期 Means flowering fruit bearing stage；C.成熟期 Means maturity stage;0、3、5和7分别代表正茬(CK)、连作3 a、连作5 a和连作7 a The number 0, 3, 5 and 7 means first-planting,three years of continuous cropping, five years of continuous cropping and seven years of continuous cropping;MK.DL 2000 plus marker。下同 The same below
图1 土壤微生物 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of microbial DNA extracted from soil

图2 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

2.2 不同连作年限的土壤细菌群落结构及多样性分析

加工番茄花果期和成熟期不同连作年限中土壤细菌的16S rDNA PCR-DGGE图谱如图3所示。各处理对应的泳道所呈现的条带数和位置差异不明显，但有个别条带的亮度存在一定的差异。土壤中的优势种群可用DGGE图谱中出现的优势条带评价，即亮条带反映土壤中某一时期菌群富集成为优势种，且亮条带数表示种群的数量。A、C、F、G、H、I、K条带均出现在所有连作泳道，但亮度不同，说明土壤中细菌优势种群随加工番茄生育时期和连作年限的变化而变化。花果期，A、F、K条带的亮度随着连作年限的增加变化不大，但K条带的亮度> F条带> A条带，说明其所代表的细菌种群受连作影响很小，K条带代表的细菌群落一直处于富集状态；成熟期，A和F条带亮度有所增加，K条带亮度变暗，但在不同连作处理下其亮度未发生明显的变化，表明A条带及F条带所代表的细菌数量有所增加，而K条带则相反。C和I条带的亮度随着连作年限的增加先明后暗，说明其所代表的细菌种群连作3 a时数量最多，成为优势种群，连作5 a后数量减少，它们的优势地位被其他种群取代；随着连作年限的延长，G和H条带代表的细菌数量在花果期基本没有发生变化，成熟期在一定程度上有所富集，且G条带在连作3 a时代表优势种群，而H条带在连作5 a时代表优势种群。个别连作泳道有其特有的条带，如在加工番茄成熟期，连作7 a泳道的J和L条带，连作5a的B、D和E条带，均代表细菌种群在该时期是优势种群。可见，加工番茄连作改变了不同生育时期土壤细菌的群落结构，一些土著细菌优势种群数量减少，甚至消失。

细菌基因组DNA的DGGE图谱共有43个带型，不同泳道的条带数在13～28条间变化，差异较大(表3)。进一步分析发现，随着加工番茄连作年限的增加，土壤细菌的丰富度和多样性逐渐下降，但成熟期的细菌多样性大于花果期，这表明连作导致加工番茄土壤生长环境趋于单一，造成细菌群落结构失衡。但从均匀度指数看，各处理样品的均匀度指数相对比较稳定，可能原因是加工番茄连作导致该群体中总体类群的改变, 但个体的丰富度变化不大。

图3 土壤细菌 16S rDNA 的PCR-DGGE图谱Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis of bacteria 16S rDNA PCR amplification products

表3 加工番茄生育期不同连作年限根际土壤微生物群落多样性Table 3 Diversity indices of microbial community in root zone soils of processing tomatoes in different continuous cropping years

2.3 不同连作年限的土壤真菌群落结构及多样性分析

如图4所示，与细菌DGGE图谱不同，各处理土壤样品中真菌基因组DNA的DGGE图谱条带明亮，背景清晰，各泳道间条带数和位置存在较大差异，且每一个泳道都有明晰可辨的独特条带(如d、g、m、o等)，连作泳道间共有条带的亮度也不同(如 b、c、e、k、l等)。条带亮度的转变意味着其所代表种群的真菌数量的变化。加工番茄连作导致a、b、c、k条带的亮度变暗，甚至消失；e、f、h、j、l条带的亮度为成熟期>花果期，其中以连作7 a 最亮，正茬(CK)最暗。个别泳道亮度明显的条带出现在特定的生育时期和连作年限。如花果期正茬处理的i条带和连作3 a时的m条带亮度最强；成熟期连作7 a处理的d、n条带亮度也最强，说明其所代表的真菌数量最多，属优势种群。随着加工番茄生育进程的延长，g条带代表的真菌数量在连作5 a时的花果期和连作7 a时的成熟期2次出现大量富集成为优势种群，而后消失；o条带所代表的真菌群落3次成为优势种群，分别出现在正茬和连作7 a处理的花果期，连作3 a处理的成熟期；p条带的亮度在所有泳道的变化不明显且比较暗淡，其所代表的真菌数量最少。进一步分析发现，加工番茄花果期和成熟期，连作7 a处理的高亮度条带数最多，与正茬(CK)相比，d、e、f、g、h、l和n等条带的亮度明显增强，而a、b、c等条带的亮度明显减弱。可见，加工番茄连作导致土壤真菌的群落结构发生变化，某些真菌类群大量富集，其他真菌类群数量减少或消失，这可能是加工番茄在不同生育时期不同连作年限下根系分泌物的数量、种类等不同所致。

图4 土壤真菌 28S rDNA 的 PCR-DGGE 图谱Fig.4 Denaturing gradient gel electrophoresis of fungal 28S rDNA PCR amplification products

与土壤细菌相比， 加工番茄各连作处理土样中共含有24条不同真菌基因组DNA的DGGE图谱条带，含有6～15种带型，且差异明显(表3，图4)。成熟期连作7 a根际土壤样品的条带数最多，正茬土壤样品的条带数最少，仅为6条。连作3 a时，花果期和成熟期土样中含有相同的条带数。从多样性指数看，土壤真菌的丰富度和多样性均随连作年限的延长呈增加趋势，这表明连作使土壤真菌的多样性水平升高，土壤微生物从细菌型向真菌型转化。从均匀度指数分析，各处理土样的均匀度指数无明显差异，说明连作虽然明显改变了土壤真菌的总体类群，但并没有造成个体丰富度的明显变化。

2.4 不同连作年限的土壤微生物聚类分析

如图5所示，聚类分析结果表明：连作明显改变了加工番茄根际土壤细菌的群落结构组成。其中，连作3 a和5 a处理距离最近，具有相似的细菌群落结构，聚为一类，且成熟期的相似性(78%)大于花果期(69%)；连作7 a处理与其他处理的差异明显，独成一支，相似性最低(49%)。从加工番茄不同生育时期分析，正茬(CK)处理的花果期和成熟期的相似性高达67%，说明正茬(CK)土壤中细菌群落结构的组成随加工番茄生育时期的变化无明显改变。花果期，当相似性为58%时，不同连作处理可聚为3类，其中正茬(CK)和连作7 a处理分别单独成为一支，连作3 a和5 a聚为一支；成熟期，当相似性为60%时，正茬(CK)、连作3 a、5 a和7 a可聚为一类。由此可见，连作对加工番茄成熟期土壤中细菌群落结构组成的影响小于花果期，说明成熟期时虽然土壤细菌数量有所减少，但其群落结构组成相对稳定。

图5 土壤细菌 16S rDNA 的 UPGMA 聚类分析Fig.5 UPGMA cluster analysis of bacteria 16S rDNA PCR amplification products

加工番茄连作土壤中真菌 DGGE图谱的聚类分析结果如图6所示。从加工番茄不同生育时期分析，当相似性为60%时，可将各处理聚为2大类，其中，花果期各连作处理的土壤真菌群落结构相似性达到64%，聚为一类；成熟期各连作处理可分成3小类：正茬(CK)和连作5 a处理相距最近，相似性为74%，聚为一类；连作3 a与其他处理的相似度性58%，独成一支；连作7 a与其他处理的相似性最低(53%)，单成一类。这表明加工番茄成熟期根际土壤真菌群落结构明显改变，而花果期根际土壤真菌群落结构的变化相对较小。同一生育时期连作明显改变土壤真菌的群落结构，连作7 a与其他处理的距离较远，相似性在64%以下，独成一支；而连作5 a以内的土壤真菌群落结构改变不显著，相似性高达72%以上。

2.5 不同连作年限的土壤微生物优势种群分析

选择图3中土壤细菌的DGGE图谱中较明亮可辨的条带C、G、H、I和K进一步扩增、测序并获取成功。由图 3可知，加工番茄不同生育时期各连作处理土壤中均存在C、G、H、I条带，但条带的亮度存在一定的差异，说明它们分别代表一种加工番茄连作土壤中土著的细菌优势种群。K条带在加工番茄花果期存在于不同连作年限土壤中，而在成熟期没有出现，说明它代表的是一种特有的存在于花果期土壤中的细菌优势种群。将上述条带的测序结果与NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)查找比对发现，存在4条与测序序列相似性最高的序列，相似性高达96%～100%(表4)，大多属于可培养细菌。加工番茄花果期C条带序列和已发表的Pseudomonassp.系列的序列相似性高达100%；成熟期G、H和I条带与已发现的未培养细菌种属核酸序列非常相近，且相似性分别高达100%、96.3%和100%。

图6 土壤真菌 28S rDNA 的 UPGMA 聚类分析Fig.6 UPGMA cluster analysis of fungal 28S rDNA PCR amplification products

表4 土壤细菌的DGGE回收条带序列分析Table 4 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil bacteria

注：大写字母C、G、H、I和K对应图3中相应的条带。
Note: The capital letter C, G, H, I and K correspond to the bands C, G, H, I and K in figure 3.

选取土壤真菌的DGGE 图谱中明亮而清晰的条带a、g、i、k、 l、 n 和 o等(图4)进行切胶回收，经PCR扩增后测序成功。将上述条带的测序结果与NCBI查找比对发现(表5)，a条带存在于加工番茄不同生育时期各连作处理土壤中，且亮度变化不大，说明其所代表的是一种加工番茄连作土壤中土著的真菌优势种群；g条带只出现于连作5 a的花果期和连作7 a处理的成熟期，且亮度清晰可辨，其与已发现的可培养Myrotheciumsp.序列的相似度为99%，可能同属真菌；i条带与不可培养真菌Uncultured fungus(JQ581576)序列的相似性为100%，说明它仅仅在正茬处理的花果期表现出优势种群。加工番茄成熟期k条带的亮度以连作7 a处理最强，连作5 a次之，连作3 a时变暗或消失，而其与Geosmithiaputterillii序列的相似性达到97%，表明Geosmithiaputterillii种群数量受连作影响而不断减少；l条带同样出现在所有土壤样品中，其中连作7 a处理的花果期和成熟期亮度均最高，而其与Rhizopusoryzae序列之间存在99%的相似性，说明Rhizopusoryzae种群数量随着连作年限的延长呈增加趋势；条带n是成熟期土壤特有的条带，连作3 a时亮度较暗，而连作7 a后显著变亮，且与Amylomycesrouxii序列有99%的相似性，意味着Amylomycesrouxii可能是土壤中真菌的优势种群；o条带与Candidatropicalis序列的相似性为96%，只见于正茬(CK)处理的花果期和连作3 a 处理的成熟期，且后者亮度较高。可见，加工番茄连作后土壤的真菌种群结构发生了变化。

表5 土壤真菌的DGGE回收条带序列分析Table 5 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil fungi

注：小写字母a、g、i、k、l、n和o对应图4中相应的条带。
Note: The lowercase letter a, g, i, k, l, n and o correspond to the bands a, g, i, k, l, n and o in figure 4.

3 讨 论

利用PCR-DGGE技术可以更加客观准确地揭示微生物群落结构的差异性变化，对研究土壤环境质量变化情况具有重要的作用。从土壤微生物DNA基因组的DGGE图谱可以看出，连作导致细菌类群共有条带的亮度变暗，而真菌类群共有条带亮度增强，说明细菌数量减少，真菌数量增加，土壤微生物群落结构趋于真菌化，这与前人得出的结论相一致[12]。作物连作障碍的成因与根际土壤微生物群落结构失衡紧密相关。多年来，前人受到实验技术的限制，多采用传统的微生物培养法研究连作对土壤微生物群落及结构变化的影响，虽然在一定程度上有助于认识和揭示连作障碍产生机理，但是该方法所得的研究结果存在较大的差异性，并不能客观、有效、全面地反映土壤微生物群落变化的情况，原因是其受试验培养条件的影响较大，且土壤中可培养微生物的种类及数量相当有限[14]。1993年PCR-DGGE 技术被Myers 等[15]首次应用到微生物生态学以来，经过多年不断的发展与改进，已经成为国内外学者研究自然界中微生物群落结构及多样性、微生物种群动态变化等的主要分子工具之一[16-18]。Buchan 等[19]利用T-RFLP 技术研究发现沼泽枯草腐败过程中细菌和真菌的群落动态演替及优势种群。马宁宁等[20]发现设施番茄长期连作并没有明显改变土壤细菌的群落结构，却显著改变了土壤真菌的群落多样性。张伟等[21]认为长期连作改变了新疆棉花土壤中细菌群落结构组成，但连作5 a后土壤细菌群落结构趋于回升和稳定。本研究通过对土壤细菌和真菌的DGGE图谱分析发现，加工番茄连作减少了土壤中土著细菌优势种群的数量，而一些土著真菌种群数量有所增加，其他真菌种群数量有所减少，说明加工番茄根际土壤微生物区系有所变化，这与前人的研究结果相似[22]。

作物连作会降低土壤微生物多样性，表现在土壤微生物群落的物种优势度、均匀度和丰富度的降低[22]。但也有不同研究结论，如马宁宁等[20]发现连作在一定程度上提高土壤细菌多样性指数，而真菌多样性指数呈先升后降，连作 20 a最高；张伟等[21]认为连作10 a以内，使得土壤细菌群落的多样性和均匀度指数逐渐增大，而丰富度指数不断下降，当连作年限超过 10 a后，土壤细菌群落各指数有所恢复或形成一种新的相对稳定状态。本研究表明，因加工番茄生育时期的变化，连作对土壤细菌和真菌群落多样性的影响差异较大，其中连作导致土壤细菌的丰富度和多样性有所降低，且成熟期>花果期，而土壤真菌群落的丰富度和多样性有所升高，且花果期<成熟期。从均匀度指数看，根际土壤细菌和真菌群落的分布都比较稳定，受加工番茄生育时期和连作年限的影响不明显。可见，PCR-DGGE技术应用在研究连作对土壤微生物群落结构的影响时，所得结构差异较大，一方面，这与所选择的真菌和细菌DNA扩增区域、PCR扩增条件、引物序列及大小等不同有关；另一方面，土壤类型、作物品种、气候条件、田间管理和施肥等均会对研究结果产生重要的影响。

土壤中细菌数量最大，有利于其群落结构保持稳定，具有较强的适应环境变化的能力。土壤真菌的数量远远少于细菌，且对土壤环境的变化极其敏感。有研究认为，土壤类型对土壤细菌群落的影响较大，而土壤管理措施对真菌群落的影响较大，原因在于土著细菌的群落结构稳定性不如土著真菌群落，尽管细菌数量比真菌数量大的多，但是土著真菌的优势种群在受到人为耕作措施、土壤温度及湿度等的影响时并没有消失[23]。本研究表明，加工番茄连作在一定程度上降低了土壤细菌的多样性和丰富度指数，同时提高了土壤真菌的多样性和丰富度指数，但土壤细菌群落结构相似性低，种群数量差异较大，和优势种群的种类和数量也存在差异；相反，连作显著降低了土壤中某些土著真菌的数量如子囊菌属(Pulchromycesfimicola)和稻根霉菌(Rhizopusoryzae)，同时也显著提高了某些真菌数量如未可培养真菌(Uncultured fungus)、漆斑菌属(Myrotheciumsp.)、毛霉菌(Amylomycesrouxii)和热带念珠菌(Candidatropicalis)，这说明土壤真菌对连作的反应更敏感。

作物连作会造成土壤中某些微生物种群富集，而某些微生物种群数量降低的结果说明土壤微生物具有选择适应性[24]。吴林坤等[25]利用T-RFLP技术研究地黄多年栽植时发现，地黄头茬土壤菌群以厚壁菌门(PhylumFirmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)占据优势地位，且富含假单胞菌、芽孢杆菌等有益生防菌，而地黄重茬根际土壤中Flexibacterpolymorphus、Clostridiumghoni以及Clostridiumsp.等病原菌大量滋生。本研究中，土壤细菌的DGGE图谱中C和I条带分别说明假单胞菌属(Pseudomonassp.)和α-变形菌(Alphaproteobacteria)是加工番茄土壤中土著的优势细菌种群，前者是一种重要的PGPR菌株(植物根际促生菌)，具有较好的生物防治土传病害发生的效果[26-28]。同时，土壤真菌DGGE图谱中各处理均含有亮度较高且独立的条带如i、g、n和o等，说明不同连作年限及不同生育时期的土壤样品中均存在升高的和降低的真菌种群，其中，g条带所代表的漆斑菌属(Myrotheciumsp.)以及n条带所代表的毛霉菌(Amylomycesrouxii)在加工番茄正茬处理的成熟期为优势种群，而条带o代表的热带念珠菌(Candidatropicalis)在连作7 a的花果期和连作5 a的成熟期大量富集，成为新的优势群落。其中，漆斑菌属(MyrotheciumTode ex Link)的病原真菌可引起加工番茄植株叶部病害，尤其露湿漆斑菌(M.roridumTode ex Fr.)是一种侵染力强、发病快、传播迅速的真菌病害，可在加工番茄采摘后引发果实的腐烂病。但关于这些微生物在土壤中的作用尚未见报道，今后还需进一步研究。可见，加工番茄连作改变了土壤真菌的优势种群平衡，可能在一定程度上引发连作障碍。

目前，国内采用PCR-DGGE法侧重于研究土壤细菌群落结构及多样性，而有关土壤真菌的相关研究比较缺乏。本试验发现，用NS1/Fung-GC作为土壤真菌的引物，能够得到条带明亮清晰、可分辨条带数量较多、背景明确的电泳图谱，有利于研究不同连作处理土壤真菌群落结构及多样性的变化情况。前人研究土壤细菌群落结构时多针对16S rDNA V3区而设计引物，结果发现由于目的片段较短，一些大小相近的细菌不能被有效地区分识别，使得在确定细菌的分类时准确性不高，误差较大[29]。本研究中，在满足 DGGE 试验条件的前提下，直接以细菌16S rDNA 的V3～V4 可变区为目的序列，增大PCR 扩增的目的片段，可以有效地区分亲缘关系相近的细菌群落。然而，扩增片段的增大也存在一些不利的因素，如电泳图谱背景模糊、条带不清晰、可分辨条带数减少、因条带增多而分离不完全等，这些问题需要通过调节电泳电压、电泳时间、染色时间及变性剂浓度梯度选择等试验条件来解决。

4 结 论

4.1 随着加工番茄连作年限的延长，根际土壤细菌的丰富度和Shannon-Wiener多样性均有所降低，且成熟期>花果期；根际土壤真菌的丰富度和多样性有所升高，且成熟期>花果期。连作对土壤细菌和真菌的Pielou均匀度指数影响不明显，说明各处理土壤微生物类群分布比较均匀。

4.2 连作明显改变了土壤中土著细菌的群落结构，一些土著细菌优势种群数量减少或消失。土壤真菌的优势种群随连作年限的变化较大，某些真菌类群大量富集，而另一些真菌数量明显减少，甚至消失，其中，加工番茄连作5 a时土壤中新出现的真菌优势种群最多，且与其他真菌种群的数量差异较大。这种加工番茄连作后土壤细菌和真菌群落结构失衡的现象可能是产生连作障碍问题的重要因素。

4.3 从条带测序结果看，各连作处理土样中细菌优势种群属于Pseudomonassp.、Arthrobacterramosus、Alphaproteobacterium、Unculturedalphaproteobacterium和Uncultured bacterium，真菌优势种群属于Uncultured fungus、Geosmithiaputterillii、Amylomycesrouxii、Candidatropicalis和Myrotheciumsp.。

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(责任编辑：潘学燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Influence of Continuous Cropping of Processing Tomato on Diversity of Microflora in the Rhizosphere Soil.

SUN Wenqing,KANG Yalong,LIU Jianguo and JIANG Guiying.

(Key Laboratory of Oasis Ecology in Agriculture of Xinjiang Construction Groups, College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China)

The objective of this experiment was to determine the effect of continuous cropping on microbial diversity in the rhizosphere of processing tomato. The field experiment, which began in 2007, was conducted at the agriculture college experiment station of Shihezi university.Processing tomato(cv.Ligeer 87-5) had been continuously cropped at the site for 1 a, 3 a, 5 a, and 7 a. Soil samples were collected during the first flowering and fruit stage and the mature stage. The microbial structure and community diversity in the rhizosphere soil was analyzed using PCR-DGGE methods. The results showed that the Shannon-Wiener index and the richness index of fungi in rhizosphere soil decreased as the duration of continuous cropping increased. In contrast, the Shannon-Wiener index and the richness index of bacteria both increased. Both indexes were greater during the mature stage than during the first flowering and fruit stage. Pielou’s index was not sensitive to the duration of continuous cropping. This indicated that the evenness of the soil microbial communities was not affected by cropping duration. Soil bacterial community structure was significantly influenced by the duration of continuous cropping. Continuous cropping caused the populations of some dominant bacterial species to decrease and even disappear. The number of dominant fungal species varied significantly depending on the duration of continuous cropping. Continuous cropping significantly increased the total fungal population; however some fungal species decreased in population or disappeared. The populations of the dominant fungal species were generally greatest in plots that had been continuously cropped to tomato for 5 a. The populations of the dominant fungal species were significantly different than those of the non-dominant fungal species. The change in the population balance between bacteria and fungi may be one important reason for reduced yields in continuously cropped fields. Sequencing analysis of prominent electrophoretic bands showed that the dominant bacteria in the rhizosphere soil werePseudomonassp.,Arthrobacterramosus,Alphaproteobacterium,UnculturedAlphaproteobacterium, and Uncultured bacterium. The dominant fungi belonged to Uncultured fungus,Geosmithiaputterillii,Amylomycesrouxii,Candidatropicalis, andMyrotheciumsp. In summary, continuous cropping of processing tomato will lead to a reduction of beneficial bacteria and an increase of pathogenic bacteria in the rhizosphere soil, which decreases the disease resistance of disease processing tomato.

Processing tomato; PCR-DGGE; Rhizosphere soil; Microbial diversity; Continuous cropping

2016-04-19 Returned 2016-06-10

National Natural Science Foundation of China(No.31260142).

SUN Wenqing, male, master. Research area:physiological-ecological characteristic.E-mail:1162656579@qq.com

JIANG Guiying,female, professor. Research area:farmland ecological environment and crop physiology. E-mail:jgy67@126.com

日期：2017-06-29

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1109.040.html

2016-04-19

2016-06-10

国家自然科学基金(31260142)。

孙文庆，男，硕士，研究方向为作物生理生态。E-mail: 1162656579@qq.com 通信作者：蒋桂英，女，教授，主要从事农田生态环境与作物生理研究。E-mail:jgy67@126.com

S154.3

A

1004-1389(2017)07-1099-12