河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒感染状态检测

张桂枝，靳双星，黄炎坤

(河南牧业经济学院 动物科技学院，郑州 450046)

河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒感染状态检测

张桂枝，靳双星，黄炎坤

(河南牧业经济学院 动物科技学院，郑州 450046)

为了解河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)感染状态，采集该鸡场绿壳蛋鸡、青脚麻鸡和固始鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清，利用ELISA方法检测泄殖腔棉拭子、蛋清和血清样品中的ALV-p27抗原及血清样品中ALV-A/B和ALV-J抗体的水平，同时采集其血液接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定。结果表明，绿壳蛋鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原阳性率分别为23.55%、11.96%和26.63%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为30.43%和16.85%，外源性ALV的分离阳性率为13.04%；青脚麻鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为 10.99%、5.43%和22.83%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为18.48%和6.52%，外源性ALV的分离阳性率为8.00%；固始鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为21.07%、12.32%和25.00%，血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为28.26%和17.39%，外源性ALV的分离阳性率为12.50%。表明3个地方品种鸡都不同程度地感染外源性ALV，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染。

地方品种鸡；禽白血病；p27抗原；A/B抗体；J抗体

禽白血病(Avian Leukosis ,AL)是由禽白血病病毒 (ALV)引起的以造血细胞增生为主的一类肿瘤性疾病。该病不仅引起感染鸡不同内脏、不同组织肿瘤及皮肤血管瘤[1-4]；感染鸡更多的表现为生长缓慢，产蛋率、受精率和孵化率降低[5-6]；同时会造成严重的免疫抑制[6]，使机体中枢免疫器官萎缩，机体抵抗力明显下降，其他疾病继发感染的几率增加；而且可通过水平和垂直传播途径在鸡群中传播，给养鸡业造成巨大的危害[1-6]。

近来，河南某鸡场地方品种鸡出现生长发育受阻、疫苗免疫失败、死淘率增加、皮肤出现大小不等的血疱等现象；剖检可见到肝、脾、肾肿大，出现肿瘤结节。根据临床症状和病理变化疑似为禽白血病。为了解该鸡场地方品种鸡禽白血病病毒的感染状况，选取有代表性的绿壳蛋鸡、青脚麻鸡和固始鸡为研究对象，利用酶联免疫吸收试验(ELISA)检测泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原，同时采集部分鸡血清检测ALV-J和ALV-A/B的抗体，了解感染禽白血病的亚群类型；并无菌采集部分鸡血液接种对内源性E亚群ALV有抵抗性的DF-1细胞，培养9 d后取细胞上清液检测ALV-p27抗原，以判断鸡群外源性ALV的感染情况，为实施中国优质地方品种鸡的净化和优质品种资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 160～175日龄绿壳蛋鸡6 072只，141～145日龄青脚麻鸡5 060只，180日龄固始鸡2 368只。

1.1.2 主要仪器设备 二氧化碳培养箱(Thermo公司 )，倒置显微镜，生物安全柜，酶标仪(Thermo公司)，微量加样器等。

1.1.3 主要试剂 ALV- p27抗原检测试剂盒为BioChek公司产品， ALV-A/B 和 ALV-J 抗体检测试剂盒为IDEXX公司产品，DMEM培养液、新生牛血清、胰酶均为GIBCO公司产品。

1.1.4 细胞 DF-1细胞由河南农业大学畜禽传染病实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 泄殖腔棉拭子ALV- p27抗原检测 采样前在样品管中加入1 mL样品稀释液(来源于试剂盒，成分为含有蛋白稳定剂和叠氮化钠的磷酸盐缓冲液)，无菌棉签采集试验鸡泄殖腔棉拭子，与稀释液混匀后冷冻。反复冻融2次，检测前将样品恢复至室温，吸取50 μL上清液，加入到ELISA反应板中，按照ELISA试剂盒操作说明检测样品中ALV-p27抗原。以405 nm的波长测定阴性对照、阳性对照和样品的吸光度，判定样品的阴、 阳性。

1.2.2 种蛋ALV- p27抗原检测 收集试验鸡的种蛋，每枚种蛋取1 mL蛋清反复冻融2次后保存，检测前将样品恢复至室温，吸取50 μL蛋清液， 加入到ELISA反应板中，按照ELISA试剂盒操作说明检测样品中的ALV-p27抗原。

1.2.3 血清ALV-p27抗原检测 采集试验鸡血液，凝固后4 000 r/min离心10 min，分离血清保存，备用。检测时吸取50 μL血清，加入到ELISA反应板中，按照ELISA试剂盒操作说明检测样品中的ALV- p27抗原。

1.2.4 ALV特异性抗体检测 用稀释液将血清样品做1∶500稀释，然后参照ALV-A/B 和 ALV-J 抗体检测试剂盒说明检测样品中ALV-A/B亚型和ALV-J亚型的抗体。

1.2.5 外源性ALV的分离鉴定 无菌采集抗凝血，接种于已长成单层的DF-1细胞，37 ℃ 继续孵育2 h，弃上清液，更换为φ(新生牛血清)=1%的DMEM培养液，在37 ℃、φ(CO2)=5%条件下继续培养9 d。然后冷冻，反复冻融2次后，用ELISA试剂盒检测细胞培养液中的ALV- p27抗原，以确定是否存在外源性ALV感染。

2 结果与分析

2.1 绿壳蛋鸡ALV感染情况

由表1可知，绿壳蛋鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中ALV- p27抗原阳性率分别为23.55%(1 430/6 072)、11.96%(33/276)、26.63%(49/184)。ALV-J亚型和ALV-A/B亚型2种抗体阳性率均较高，ALV-A/B达到30.43%，ALV-J也达到16%以上(16.85%)。统计分析结果显示，2种抗体均为阳性的个体占15.28%；外源性ALV分离阳性率为13.04%(12/92)。结果表明，绿壳蛋鸡鸡群存在外源性的禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染的情况。

2.2 青脚麻鸡ALV感染情况

由表2可知，青脚麻鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为 10.99%(556/5 060)、5.43%(15/276)和22.83%(21/92)。ALV-A/B抗体阳性率为18.48%(17/92)，ALV-J抗体阳性率为6.52%(6/92)，部分个体2种抗体均为阳性。外源性ALV分离阳性率为8.00%(4/50)。说明青脚麻鸡鸡群中存在外源性禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染的情况。青脚麻鸡的抗原阳性率和抗体阳性率都低于绿壳蛋鸡。

表1 绿壳蛋鸡ALV-p27抗原和ALV 抗体检测Table 1 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of blue egg chicken

2.3 固始鸡ALV感染情况

由表3可知，固始鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率为分别为21.07%(499/2368)、12.32%(34/276)和25.00%(23/92)。ALV-A/B抗体阳性率为28.26%(26/92)，ALV-J抗体阳性率为17.39%(16/92)，部分个体2种抗体均为阳性。外源性ALV分离阳性率为12.50%(5/40)。说明固始鸡鸡群存在外源性禽白血病病毒感染，且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染。

表2 青脚麻鸡ALV-p27抗原和ALV 抗体检测Table 2 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of partridge shank chicken

表3 固始鸡ALV-p27抗原和ALV 抗体检测Table 3 ALV-p27 antigenand ALV antibody test results of gushi chicken

3 结论与讨论

3.1 禽白血病病毒感染状况

自20世纪90年代末J 亚群禽白血病传入中国以来，流行和发病情况日趋严重，从早期的肉种鸡感染，蔓延到蛋鸡，再到国内很多的地方鸡种[7-14]。本研究采集河南地区地方品种鸡泄殖腔棉拭子、蛋清、血清等样品检测ALV的感染情况。通过研究发现，绿壳蛋鸡、固始鸡和青脚麻鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中ALV-p27抗原阳性率均较高。同一批鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清的ALV-p27抗原阳性率有差异，分析发现，某些个体泄殖腔棉拭子、蛋清和血清的ALV-p27抗原均为阳性，部分个体只有泄殖腔棉拭子抗原阳性或血清抗原阳性，而只有蛋清抗原阳性的个体不足1%。3 个地方品种鸡均是血清抗原阳性率最高，其次是泄殖腔棉拭子，蛋清抗原阳性率最低。说明绿壳蛋鸡、固始鸡和青脚麻鸡血液和泄殖腔带毒率较高，蛋清带毒率较低，但前者并不完全覆盖后者。3 个品种鸡间感染程度有一定差异，青脚麻鸡较其他2 个品种鸡感染轻微。

ALV特异性抗体水平反映鸡群禽白血病病毒的感染情况以及感染过的主要亚群，对禽白血病的净化有一定指示作用。从本研究的抗体检测情况来看，绿壳蛋鸡、固始鸡和青脚麻鸡血清中ALV-A/B和ALV-J抗体均检出阳性个体，并且部分个体2种抗体均为阳性，其中绿壳蛋鸡ALV-A/B抗体阳性率最高达30%以上，固始鸡ALV-J抗体阳性率最高达17.39%，3个品种均是ALV-A/B抗体阳性率大于ALV-J抗体阳性率。说明3个地方品种鸡同时存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染的可能，ALV-A/B 亚群感染率大于ALV-J亚群 。研究结果与常维山等[8]报道的地方品种鸡群中ALV-J 亚型和 A/B 亚型白血病病毒感染很普遍的结果一致，但与张胜斌等[14]报道的ALV-A/B 亚群抗体的总阳性率相对较低、J 亚群抗体的总阳性率较高有差异。

3.2 内、外源禽白血病病毒的区分

ALV可分为内源性病毒和外源性病毒。鸡的外源性ALV是指不会通过宿主细胞染色体传递的病毒，包括A、B、C、D和J亚群；内源性ALV通常指E 亚群ALV，是指可整合进宿主细胞染色体基因组的前病毒cDNA，因而可通过染色体垂直传递，但通常致病性或致瘤性很低或完全没有。目前对禽白血病的防控主要采用对种鸡群开展外源性ALV检测净化。DF-1细胞培养分离病毒被视为种鸡群净化的国际金标准，因为只有外源性 ALV可以在DF-1细胞系上生长，而内源性的 ALV-E 亚群不能在该细胞系上生长[3,7]。本研究将绿壳蛋鸡、固始鸡和青脚麻鸡的血液分别接种DF-1细胞，培养9 d后，其细胞培养液中均检测到ALV-p27抗原，外源性ALV的分离阳性率分别为13.04%、12.50%和8.00%，检出率低于泄殖腔棉拭子和血清样品，略高于蛋清样品。结果表明3个地方品种鸡均已感染外源性的禽白血病病毒。

从本研究的检测结果看，ALV 在河南地方品种鸡群中感染率较高。随着致病力极强的ALV-J的出现及广为传播，加之针对该病又无可用免疫疫苗，其感染的鸡不断出现患瘤死亡、生产性能下降和免疫抑制等，不仅对原种鸡的生产产生消极影响，对父母代种鸡造成的破坏更是呈指数级增大。因此，根据地方品种鸡的特点，制定合理的净化方案，加强地方品种鸡禽白血病的净化已迫在眉睫。

Reference：

[1] 张小桃,史伟伟,刘红波,等.血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定[J].畜牧兽医学报，2010,41(2):193-199.

ZHANG X T,SHI W W,LIU H B,etal.Isolation and the full-length genome sequencing of subgroup J avian leukosis virus ZH-08 isolate associated with hemangioma[J].ActaVeterinariaetZootcchnicaSinica,2010,41(2):193-199(in Chinese with English abstract).

[2] 张丹俊,赵瑞宏,沈学怀,等.黄羽肉鸡J亚群禽白血病肿瘤及相关病变发生规律的研究[J].中国家禽,2013,35(20):17-19.

ZHANG D J,ZHAO R H,SHEN X H,etal.Tumors and related process induced by avian leukosis virus subgroup J in yellow-feather broilers [J].ChinaPoultry,2013,35(20):17-19(in Chinese with English abstract).

[3] 徐海鹏,孟凡峰,董 宣,等.种蛋中内源性禽白血病病毒的检测和鉴定[J].畜牧兽医学报,2014,45(8):1317-1323.

XU H P,MENG F F,DONG X,etal.Detection and identification of an endogenous subgroup E avian leukosis virus in a chicken breeder embryo[J].ActaVeterinariaetZootcchnicaSinica,2014,45(8):1317-1323(in Chinese with English abstract).

[4] 崔治中.禽白血病病毒研究的过去、现在和将来[J].生命科学,2012,24(4):305-308.

CUI ZH ZH.The past,present and future in the studies of avian leukosis viruses [J].ChineseBulletinofLifeSciences,2012,24(4):305-308(in Chinese with English abstract).

[5] 尹 月,兰 茜,李天杰,等.J亚型禽白血病病毒对鸡产蛋性能的影响[J].四川农业大学学报,2013,31(2):211-215.

YIN Y,LAN X,LI T J.etal.The effects of avian leukosis virus subgroup J on chicken laying performance [J].JournalofSichuanAgriculturalUniversity,2013,31(2):211-215(in Chinese with English abstract).

[6] 商营利,刘思当,丁宝君,等.鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理[J].中国兽医学报,2005,25(6):573-577.

SHANG Y L,LIU S D,DING B J,etal.Immunosuppressive mechanism of broilers infected with avian leukosis virus subgroup[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2005,25(6):573-577 (in Chinese with English abstract).

[7] 王 波,李清源,刘绍琼,等.皖南黄肉种鸡种蛋中禽白血病病毒的感染状态检测[J].畜牧兽医学报,2011,42(2):224-227.

WANG B,LI Q Y,LIU SH Q,etal.Evaluation on ALV infection in fertilized eggs from a wan-nan yellow-feather parent broiler breeder flock[J] .ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2011,42(2):224-227 (in Chinese with English abstract).

[8] 常维山,郭慧君,孙淑红.近年来我国禽白血病流行现状及发展趋势分析[J].中国家禽,2010,32(1):8-10.

CHANG W SH,GUO H J,SUN SH H,etal.Analysis on the current situation and development trend of avian leukemia in China in recent years[J].ChinaPoultry,2010,32(1):8-10(in Chinese).

[9] 梁雄燕,杨玉莹,顾玉芳,等.湖北部分肉种鸡J亚群禽白血病血清学调查及PCR检测[J].湖北农业科学,2009,48(11):2636-2638.

LIANG X Y,YANG Y Y,GU Y F,etal.Serological investigation and PCR detection for avian leukosis subgroup J in part of hubei meat-type chicken flocks[J].HubeiAgriculturalSciences,2009,48(11):2636-2638 (in Chinese with English abstract).

[10] 俞 燕,朱鸿媛,高明燕,等.地方鸡种禽白血病病毒感染动态及检测方法比较[J].中国家禽,2014,36(8):23-26.

YU Y,ZHU H Y,GAO M Y,etal.Dynamic change and different detection methods for avian leukosis virus in indigenous chickens during brooding and rearing periods[J].ChinaPoultry,2014,36(8):23-26 (in Chinese with English abstract).

[11] 高玉龙,邵华斌,罗青平,等.2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2010,32(1):32-35.

GAO Y L,SHAO H B,LUO Q P,etal.Molecular epidemiology of avian leukosis virus isolates from some regions of China in 2009[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2010,32(1):32-35 (in Chinese with English abstract).

[12] SUN S,CUI Z.Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in Chinese local “yellow” chickens [J].AvianPathoogyl,2007,36(3): 221-226.

[13] 孙 淼,李金彩,郭振华,等.J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2009,45(10): 46-48.

SUN M,LI J C,GUO ZH H,etal.Isolation and identification of avian leukosis virus subtype J[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine,2009 ,45(10): 46-48 (in Chinese with English abstract).

[14] 张胜斌,吴天威,韦 平,等.地方优良鸡种禽白血病病毒感染调查及净化[J].中国家禽,2010,32(12):11-16.

ZHANG SH B,WU T W,WEI P,etal.Investigation of avian leukosis virus infections and eradication practices in local lines of chickens[J].ChinaPoultry,2010,32(12):11-16 (in Chinese with English abstract).

(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Evaluation of ALV Infection in Henan Local Chicken Strains

ZHANG Guizhi,JIN Shuangxing and HUANG Yankun

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In order to understand ALV(Avian Leukosis Virus,ALV) infection status of local chicken strains in a chicken farm of Henan ,the Cloacal swab,egg-white and serum samples were collected from Henan blue egg chicken,partridge shank chicken and gushi chicken.ALV-p27 antigen of all samples and ALV-AB and ALV-J antibody of serum were directly detected by ELISA.The exogenous ALV was isolated and identified after DF1 cells were inoculated by blood.The results showed that positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs,egg-whites and serumsin blue egg chicken was 23.55%,11.96% and 26.63%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 30.43% and 16.85%,and positive rate of exogenous ALV was 13.04%.The positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs,egg-whites and serumsin partridge shank chicken was 10.99%,5.43% and 22.83%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 18.48% and 6.52%,and positive rate of exogenous ALV was 8.00%.The positive rates of ALV-p27 antigen of Cloacal swabs ,egg-whites and serums in gushi chicken were 21.07%,12.32% and 25.00%,positive rates of ALV-AB and ALV-J antibody of serums were 28.26% and 17.39%,and positive rate of exogenous ALV was 12.50%.Together,these data indicated that 3 breeds of local strains chicken were infected with exogenous ALV in different degrees and there may be chicken simultaneously inflected by 2 or 3 subtypes of ALV-A/B and ALV-J.

Local chicken strains; Avlan leukosis; p27 antigen; AB antibody; J antibody

ZHANG Guizhi,female,master,associate professor.Research area:animal disease prevention.E-mail: zhangguizhi666@126.com

日期：2017-03-03

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.072.html

2016-03-13

2016-06-12

河南省科技攻关计划(152102110089)；校科技创新团队项目(HUAHE2015003)。

张桂枝，女，副教授，硕士，主要从事畜禽疫病防治的研究。E-mail: zhangguizhi666@126.com

S831.7

A

1004-1389(2017)03-0350-05

Received 2016-03-13 Returned 2016-06-12

Foundation item Key Scientific and Technological Project of Henan Province(No.152102110089);Science and Technology Innovation Project of Henan University of Animal Husbandry and Economy(No.HUAHE2015003).