易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

张慧艳，刘芝瑾，徐 同，马金福，梁 凯，罗晓霞

(新疆生产建设兵团 塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学 生命科学学院，新疆阿拉尔 843300)

易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

张慧艳，刘芝瑾，徐 同，马金福，梁 凯，罗晓霞

(新疆生产建设兵团 塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学 生命科学学院，新疆阿拉尔 843300)

为了探索嗜盐放线菌对高盐环境的适应机理,以分离于罗布泊易变链霉菌TRM 45540为材料，利用分子克隆技术，构建四氢嘧啶异源生物合成工程菌(以E.coli为宿主)，对ectA、ectB、ectC与ectABC基因进行异源表达，分析异源宿主菌的耐盐能力。结果表明：TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为 474 bp，预测编码蛋白为19 ku；ectB为1 272 bp，预测编码蛋白为44.6 ku；ectC为399 bp，预测编码蛋白为19 ku；全长基因ectABC为2 403 bp，并且携带有ectABC基因工程菌的耐盐能力显著提高。

易变链霉菌；四氢嘧啶；基因克隆

极端微生物因其在极端环境中特殊的适应能力，引起科学家的广泛兴趣并成为微生物研究领域的热点[1]。中度嗜盐菌与极端嗜盐菌相比，具有更宽的盐适应范围。中度嗜盐菌通常能够在细胞内高浓度累积小分子有机渗透溶质，如糖、多元醇、甜菜碱及氨基酸等，使细胞内外渗透压达到平衡[2-5]。Galinski通过HPLC和NMR的方法对不同盐环境菌株细胞内相容性溶质进行分析，结果发现，在放线菌中的相容性物质种类丰富，四氢嘧啶是一种主要的相容性溶质存在于细胞质中[6]，而中度嗜盐菌为了在高盐环境下求得生存，需要依赖这种相容性物质，在以色列盐单胞菌[7]、嗜盐海球菌[8]、巴斯德氏盐水芽孢杆菌[9]均有报道。

四氢嘧啶为N-乙酰化二氨基丁酸通过分子内脱水形成的一种嘧啶衍生物，四氢嘧啶分子结构特点是高度水溶性、不带静电荷，在细胞内高浓度积累可以提高细胞内的渗透压，但不会影响生物大分子的正常生理功能。以天冬氨酸为前体的四氢嘧啶合成途径，是由 L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)开始合成的，中间经过3个步骤，第1个反应：2,4-二氨基丁酸转氨酶(EctB)催化ASA生成L-2,4-二氨基丁酸(DABA)；第2个反应：2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)将DABA乙酰化成N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(ADABA)；最后，四氢嘧啶合成酶(EctC)催化ADABA环化成四氢嘧啶[10-11]。

菌株TRM 45540分离于新疆罗布泊土壤环境，NaCl适应范围广，生长快，为典型的中度嗜盐菌，是研究耐盐放线菌耐盐机制的良好材料。本研究通过分析已发表四氢嘧啶合成基因相关序列的保守结构域，利用生物信息学技术，扫描TRM 45540菌株的全基因组序列[12]，找到与四氢嘧啶合成相关的序列，以此设计引物，扩增获得四氢嘧啶合成相关基因ectABC，获得ectABC重组子，检测重组子对不同质量浓度NaCl的耐受能力。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 易变链霉菌(Streptomycesmutabilis) TRM 45540 (与标准菌株StreptomycesmutabilisNBRC 12800T相似性为99.79%)。使用ISP-4培养基，添加0.05 g/mL NaCl，37 ℃培养5～7 d。

1.1.2 主要仪器和试剂 PCR仪:德国Senso Quest Labcycler；凝胶成像系统：美国BIO-RAD；高速离心机：德国Eppendorf；电泳仪：北京六一。

菌株或质粒：表达载体pET-28a(+)和E.coliBL21(DE3)感受态细胞均来自塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室微生物资源研究室。

PCR扩增全套试剂购自广州东盛生物科技有限公司；连接试剂盒，pMD18-T载体试剂盒，限制性内切酶HindⅢ，BamH Ⅰ和EcoRⅠ，T4DNA Ligase购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)；胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；一抗：抗His标签鼠单克隆抗体(Protein FindTMAnti-His Mouse Monoclonal antibody)，二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Protein FindTMGoatAnti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate)购自北京全式金生物技术有限公司(TransGen)；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 四氢嘧啶合成相关基因克隆

四氢嘧啶合成过程中相关的基因有3个：ectA，ectB和ectC。在四氢嘧啶合成基因簇中，ectABC基因形成1个操纵子结构，共用1个启动子。通过GenBank中已发表的ectABC序列，找到每个基因的保守结构域，利用生物信息学技术，扫描菌株的全基因组序列[12]，分别找到多条与四氢嘧啶合成基因相关的区域，选择相邻近的3段区域设计引物，进行PCR扩增，得到与四氢嘧啶合成相关的基因ectA，ectB和ectC及ectABC全长序列，转化E.coliDH5α感受态细胞，将获得的阳性转化子送样测序。

引物设计见表1(下划线表示加入的酶切位点)：下划线碱基GGATCC为限制性内切酶BamHⅠ，下划线碱基AAGCTT为限制性内切酶HindⅢ，下划线碱基GAATTC为限制性内切酶EcoRⅠ。

表1 四氢嘧啶基因引物序列Table 1 Primer sequence of ectoine gene

1.3 表达质粒的构建与转化

用BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对目的PCR片段和表达载体pET 28a分别进行双酶切(ectA基因用BamHⅠ和HindⅢ，ectB基因用EcoRⅠ和HindⅢ，ectC基因用BamHⅠ和HindⅢ)，酶切后用T4DNA连接酶连接获得重组质粒，转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，PCR验证重组子，挑取阳性克隆子测序。

1.4 Western blot 检测

将纯化的EctA，EctB和EctC蛋白进行SDS-PAGE检测，用Mini-Trans Blot 转膜仪120 V 电压转膜1 h，用封闭液进行过夜封闭后，分别用一抗二抗各孵育1 h后，用DAB显色。

1.5 耐盐度测定

配制不同NaCl质量浓度的LB培养基，以载体和E.coliBL21(DE3)感受态细胞为对照，观察重组子的耐盐性。

2 结果与分析

2.1 四氢嘧啶合成基因的克隆

2.1.1ectC的克隆 通过全基因组扫描，在菌株TRM 45540基因组中筛选到1条与ectC基因相似的序列，以筛选的序列为模板设计引物，经PCR扩增后，扩增到与目的条带一样大小的片段(图1)，大小为399 bp，将扩增得到的片段克隆测序后与NCBI数据库序列进行比对，发现其具有Ectoin_synth保守结构域，与四氢嘧啶合成相关，并且该片段与已发表的四氢嘧啶合酶(ectoine synthase)的一致性为98%。

ectABC基因形成一个操纵子结构，通过保守结构域的分析及预测，在TRM 45540菌株基因组中分别扫描预测到1条与ectA和ectB基因相关的序列(图1-A)。以TRM 45540的总DNA为模板，以45540ectA-R，45540ectA-F和45540ectB-R，45540ectB-F为引物进行PCR扩增，结果见图1。引物对45540ectA-F和45540ectA-R扩增得到与预期大小相符的片段约500 bp(图1-B)，引物对45540ectB-F和45540ectB-R扩增得到与预期片段大小相符的约1 200 bp 的片段。引物对ectA-F和ectC-R扩增得到四氢嘧啶合成基因簇ectABC的全长序列，ectABC全长约 2 403 bp(图1)。将PCR扩增的目标片段进行双酶切后与载体进行连接并转化DH5α。用碱裂解法抽提重组菌的质粒(图1-C)，分别对重组质粒ectA+T/DH5α (HindⅢ+BamHⅠ),ectB+T/DH5α(HindⅢ+EcoRⅠ)和ectC+T/DH5α(HindⅢ+BamHⅠ)进行双酶切验证。TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为474 bp，ectB为1 272 bp，ectC为399 bp，全长基因ectABC为2 403 bp(图1-D)。

A.四氢嘧啶合成基因的结构; ectA有474 bp,ectB有1 272 bp,ectC有399 bp,ectABC有2 403 bp。 B.四氢嘧啶合成基因的PCR扩增结果; M.DNA marker(DL2000),1.ectA(474 bp),2.ectB(1 272 bp),3.ectC(399 bp),4.ectABC(2 403 bp)。C.四氢嘧啶合成基因重组质粒验证; 1.pUC19/DH5α,2.ectA+T/DH5α,3.pUC19/DH5α,4.ectB+T/DH5α,5.pUC19/DH5α,6.ectC+T/DH5α,7.pUC19/DH5α,8.ectABC+T/DH5α。 D.四氢嘧啶合成基因重组质粒的酶切验证; 1.ectA+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ，2.ectA+T/DH5α，3.ectB+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 4.ectB+T/DH5α， 5.ectC+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 6.ectC+T/DH5α， 7.ectABC+T/DH5α (Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 8.ectABC+T/DH5α，9.pUC19(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)，10.pUC19， M1.DNA Marker(plusⅡ)，M2.DNA Marker(λHind Ⅲ)

2.1.2ectA、ectB和ectC基因的分析及异源表达 通过与NCBI数据库进行比对分析ectA、ectB、ectC基因的保守结构域，结果显示：TRM 45540中ectA基因含有1个与2，4-二氨基丁酸乙酰转移酶(2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase)合成相关的保守结构域NAT-SF(N-Acyltransferase superfamily)；将序列通过Blastx比对，发现TRM 45540ectA基因与Streptomycessp.TOR3209的2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase一致性为97%，对ectA基因进行异源表达，通过SDS-PAGE检测EctA蛋白大小为19 ku，与预测大小一致(图2-A)；ectB基因含有1个与2，4-二氨基丁酸转氨酶(L-2,4-diaminobutyric aminotransferase)合成相关的保守结构域AAT-I superfamily(Aspartate aminotransferase superfamily)，将序列通过Blastx比对，ectB基因与StreptomycesbottropensisATCC 25435的L-2,4-diaminobutyric aminotransferase一致性为93%，对ectB基因进行异源表达，通过SDS-PAGE检测EctB大小为44.6 ku，与预测大小一致(图2-B)；ectC基因含有1个与四氢嘧啶合成酶(ectoine synthase)合成相关的保守结构域EctC(Ectoine-synth Superfamily)，将序列通过Blastx比对，TRM 45540ectC基因与Streptomycessp.TOR3209的ectoine synthase 一致性为98%,对ectC基因进行异源表达，通过SDS-PAGE检测EctC大小为19 ku，与预测大小一致(图2-C)。

2.2 四氢嘧啶合成基因的耐盐性鉴定

将携带有四氢嘧啶基因的重组菌分别接种于含NaCl 0、0.01、0.03、0.05 g/mL的LB培养基中，以pET32a/DH5α、puc19/DH5α和pET32a/ BL21(DE3) (载体)为阴性对照，以TRM 45540 为阳性对照，观察重组子的耐盐性(图3)。

由图3可以看出，重组菌能够在0.01 g/mL含盐培养基上生长，而在0.03 g/mL的培养基上生长较为微弱，在0.05 g/mL的含盐培养基上不能生长，pET 28a/ DH5α、pET 28a/ DH5α和pET 28a/ BL21(DE3)均不能在0.03 g/mL和0.05 g/mL的含盐培养基上生长。而包含有ect基因的重组菌ectABC+pET-28a/DH5α、ectABC+pET-28a/BL21(DE3)能够在0.05 g/mL含盐培养基中生长，由此证明ect基因能够提高重组菌对NaCl的耐受性。

A: ectA基因的异源表达SDS-PAGE检测, M.蛋白质Marker(80 ku),1. pET-28a/BL21(DE3), 2. ectA+pET-28a/ BL21(DE3), 3.Ect5A(上样量为5 μL) , 4. Ect5A(上样量为10 μL); B: ectB基因的异源表达SDS-PAGE检测, M.蛋白质Marker(80 ku),1.ectB+pET-28a/BL21(DE3), 2.EctB(上样量为5 μL), 3. EctB(上样量为10 μL), 4. pET-28a/BL21(DE3); C: ectC基因的异源表达SDS-PAGE检测, M. 蛋白质Marker(80 ku), 1. EctC(上样量为 5 μL), 2. ectC+pET-28a/BL21(DE3), 3. pET-28a/BL21, 4.EctC(上样量为 10 μL); D: EctA、 EctB、EctC蛋白Western blot 检测, M. 蛋白质Marker(80 ku), 1. EctA, 2.EctB, 3.EctC,4.pET-28a/BL21

3 讨 论

嗜盐放线菌分布广泛，不论是普通环境的低盐土壤还是饱和盐浓度的环境均能存在，他们包含几乎所有的代谢类型，他们独特的基因类型，特殊的生理机制及包括次级代谢产物在内的新活性分子，使盐环境，尤其是极端盐环境成为发现新微生物资源及新活性分子的宝库。罗布泊位于新疆塔里木盆地东部，若羌县境内，曾是中国第二大内陆湖，在20世纪中后期因塔里木河流量减少，周围沙漠化严重，使其迅速退化并干涸。罗布泊含有丰富的钾盐矿藏资源，是国内为数不多超大型钾盐矿之一[13]。这为研究中度嗜盐菌盐适应机制提供一个崭新的平台。

四氢嘧啶是一种广泛存在于嗜盐微生物中的相容性溶质。在高渗透压胁迫下，嗜盐微生物会在细胞内累积大量四氢嘧啶来平衡细胞内外渗透压；在低渗透压下，微生物则会向细胞外释放细胞内的四氢嘧啶。通过这种方式，使许多嗜盐微生物可以在高温、干旱、盐碱等极端环境存活。目前已从多种微生物中克隆到与四氢嘧啶合成相关的基因[14]。

本试验以一株完成全基因组测序的中度嗜盐链霉菌为研究对象，通过生物信息学分析预测除与四氢嘧啶合成基因簇相关的序列，以基因组序列作为模板设计四氢嘧啶合成基因簇的引物，扩增得到目标片段并进行测序验证。TRM 45540四氢嘧啶合成相关的基因全长2 403 bp，由3个ORF组成，为一个操纵子结构。通过BLAST比对分析，TRM 45540与Streptomycessp.TOR3209的ectABC基因亲缘关系最相近，TRM 40136ectABC基因可能为一新基因。通过盐耐受试验表明，TRM 45540 四氢嘧啶合成相关的基因能够提高重组菌对NaCl的耐受能力。生理生化试验表明，TRM 45540可在0～0.08 g/mL的NaCl质量浓度下生长，最适生长的NaCl质量浓度为0.05 g/mL，通过重组菌盐耐受试验，发现TRM 45540的四氢嘧啶合成相关的基因明显提高重组菌的盐耐受能力，但是重组菌对NaCl的耐受能力仅为0.05 g/mL，而不同于野生菌TRM 45540可以耐受较高的NaCl质量浓度，通过对TRM 45540的全基因组序列分析，还发现在TRM 45540中存在多个与耐盐相关的相容性溶质合成基因，如海藻糖合成相关基因(tps和tpp)、甘露醇合成相关基因(mtlD)和甜菜碱合成相关基因(betA和betB)等。因此推测：TRM 45540之所以能够耐受较高的NaCl质量浓度，可能与多个相容性溶质协同作用有关。

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(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Cloning of Biosynthetic Gene Cluster of Ectoine fromStreptomycesmutabilisTRM 45540

ZHANG Huiyan,LIU Zhijin,XU Tong,MA Jinfu,LIANG Kai and LUO Xiaoxia

(Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production&Construction Corps/College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

The aim of this study is to conduct research into adaptive mechanism of halophile actinomycetes in hypersaline environments.The wide type strainStreptomycesmutabilisTRM 45540 was used as material,we inserted theectA,ectB,ectCandectABCinto the expression vector pET28a to generate recombinant plasmidsectABC+pET-28a/BL21(DE3),then analyzed the salt tolerance of recombinants.The results showed thatectABCgene was 2 403 bp,including three subunits such asectA,ectBandectC.EctAgene was 474 bp,the encoding protein 19 ku,ectBgene 1 272 bp,the encoding protein 44.6 ku;ectCgene was 399 bp,the encoding protein was 19 ku.Moreover,the recombinant showed higher salt tolerance.

Streptomycesmutabilis；Ectoine；Gene clone

ZHANG Huiyan,female,undergraduate.Research area:application of biological science.E-mail: 1018630306@qq.com

LUO Xiaoxia,female,associate professor.Research area:extremophiles functional genes.E-mail：xxluo415@163.com

日期：2017-03-03

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0832.046.html

2016-01-24

2016-07-25

兵团博士基金(2014BB008)；塔里木大学校长基金(TDZKBS201301)；塔里木大学国家级大学生创新项目(201410757012)。

张慧艳,女，本科生，研究方向为应用生物科学。E-mail：1018630306@qq.com

罗晓霞，女，副教授，研究方向为极端微生物功能基因。E-mail：xxluo415@163.com

Q786

A

1004-1389(2017)03-0471-06

Received 2016-01-24 Returned 2016-07-25

Foundation item Ph.D Foundation of Xinjiang Production & Construction Corps(No.2014BB008); the President Foundation of Tarim University (No.TDZKBS201301); National Innovative Project for College Students(No.201410757012).