果胶酶和浸渍处理对苹果酒香气成分的影响

程拯艮，黄 佳，苗 壮，戚一曼，樊明涛，魏新元

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100)

果胶酶和浸渍处理对苹果酒香气成分的影响

程拯艮，黄 佳，苗 壮，戚一曼，樊明涛，魏新元

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100)

为明确发酵过程不同浸渍时间(4 d、8 d和12 d)和果胶酶处理对苹果酒品质的影响，运用顶空固相微萃取(HP-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)法测定不同处理所酿造的苹果酒香气组分，同时测定不同条件下所酿造的苹果酒的澄清度。结果表明：果胶酶处理过的酒样澄清度均在95%左右，未添加果胶酶的酒样澄清度较低，且浸渍12 d未添加果胶酶的酒样(C12)澄清度最低(33.17%)。苹果酒样中共检测出以醇类、酯类和脂肪酸类香气为主的香气成分51种。浸渍处理酒样中醇类香气浓度比清汁发酵酒更高，果胶酶处理后苹果酒中杂醇油含量降低。浸渍时间越长酯类质量浓度越低，4 d浸渍处理的酒样酯类香气质量浓度最高。清汁发酵未添加果胶酶酒样(C0)(1 273.28 μg/L)中脂肪酸类香气物质质量浓度最高，浸渍4 d添加果胶酶的酒样(E4)(390.55 μg/L)中质量浓度最低。所以4 d短时浸渍处理并添加果胶酶进行苹果酒酿造的工艺对改善苹果酒香气风味有很大作用。

香气；苹果酒；浸渍；果胶酶；气质联用

苹果是中国主要水果经济作物之一，据国家统计局数据统计，2013年中国苹果种植面积达到227万hm2，2014年苹果产量高达4 092万t，居世界首位。虽然中国苹果产量大幅度增加，但优质苹果所占比例还有待提高，在不同的苹果产区，优质苹果以较高的价格鲜销，而大量个小、形体不端等次级苹果销售价格往往很低，用这类苹果进行深加工是一个不错的选择[1]。

苹果酒作为世界第2大发酵果酒，备受人们的关注和喜爱[2]。苹果酒拥有较高的营养成分和保健价值[3-5]。其含有丰富的维生素、矿物质、氨基酸以及多酚等物质，能起到软化血管，降低血脂、血压，调节人体新陈代谢，抗衰老及一定的抗癌作用[6-9]。苹果酒的品质和发酵工艺息息相关[10-12]，传统苹果酒发酵是用鲜果榨汁后接种酵母菌进行酒精发酵，大量的果渣得不到利用，造成极大的浪费和污染。本试验欲采取浸渍发酵法进行苹果酒的酿制，充分利用苹果果渣，提高苹果酒品质并减少浪费和污染。浸渍处理在葡萄酒发酵工艺中极为常见[13-16]，能起到改善葡萄酒色泽、风味、抗氧化能力以及提升香体丰满度等效果[14,17-22]，但该处理在苹果酒发酵中的应用鲜见报道。果胶酶作为常用酶能对酒体的风味起到很好的改善作用[8,17,23-25]，因此，本试验根据不同的浸渍时间并辅以果胶酶进行苹果酒酿造，研究浸渍处理和果胶酶添加对苹果酒香气成分的影响，以期能确立新的苹果酒发酵工艺，为苹果酒发酵研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 酿酒材料及试剂

苹果原料：以采自西北农林科技大学白水苹果试验站的新鲜富士苹果为酿酒原料；酿酒酵母：ZYMAFLORE F15(法国LAFFORT公司)；果胶酶：Macerozyme R-10(北京索莱宝科技有限公司)。

仪器设备：7890A-5975C气质联用仪(美国Agilent公司)；手动固相微萃取(50/30 μm DVB/CAR/SPME)进样器(美国Supelco公司)；中极性毛细管柱DB-1701(30 m×250 μm×0.25 μm)。

试剂：NaCl，3-辛醇，亚硫酸。

1.2 试验设计

试验的处理酒样分别为清汁发酵苹果酒、浸渍发酵4 d、8 d和12 d苹果酒，每种酒样又各有不添加果胶酶和添加50 mg/L果胶酶2种处理，共计8种处理酒样。各处理酒样具体命名方式见表1。

表1 不同条件发酵酒样命名Table 1 Labels of wine samples

1.3 苹果酒酿造工艺

1.3.1 发酵工艺流程 发酵工艺流程见图1。

图1 发酵工艺流程图Fig.1 Procedure chart of fermentation

1.3.2 操作要点 发酵前处理：将苹果清洗后破碎，得苹果果浆倒入发酵罐，添加亚硫酸使终质量浓度为60 mg/L，添加50 mg/L果胶酶于25 ℃保温12 h。

酵母活化：将酵母菌用YPD培养基在37 ℃进行扩大培养，按照果浆体积的4.0%取菌液，6 000 r/min 离心10 min后，加入20 mL苹果浆震荡培养4 h，加入发酵罐18 ℃发酵，每天搅拌发酵液，使发酵液均匀。

分期压榨：在发酵经4 d和8 d时分别从发酵罐中取部分发酵浆液进行压榨，并将发酵液转入新发酵罐中继续发酵至12 d，取出所有发酵液，压榨倒罐后于合适温度下陈酿。陈酿6个月后分别取各处理酒样测定香气成分。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 澄清度 取各酒样于680 nm下测定吸光度，按照公式A680=2-log(T)换算澄清度，其中A680为酒样吸光度，T为透光率，即澄清度[26]。

1.4.2 香气成分分析 香气成分萃取：准确吸取各处理酒样5 mL至15 mL固相微萃取专用萃取瓶中，添加3-辛醇作为内标，并加入1 g NaCl后密封。于40 ℃水浴中平衡10 min，插入经老化的萃取头萃取30 min。萃取完毕后，迅速取下萃取器，插入气相色谱仪进样口于260 ℃下解析5 min。

GC-MS条件：程序升温至40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min速率升温至80 ℃，再按10 ℃/min升到250 ℃；进样口温度260 ℃，载气为He，流速1 mL/min；不分流进样。离子源温度为230 ℃，扫描范围是35～400 amu，EI离子源能量 70 eV。

数据分析：利用随机Xcalibur工作站NIST2002标准谱库自动检索各组分质谱数据，按内标法计算各组分质量浓度，内标物为3-辛醇，计算公式如下：

C1=A1C2/A2

其中，C1是被测组分相对质量浓度；C2为内标物质量浓度；A1为被测组分峰面积；A2为内标物峰面积。

1.4.3 数据处理 采用软件Excel 2013对试验数据进行处理，用SPSS 20.0进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 澄清度比较

不同苹果酒样的澄清度如图2所示，不加酶处理组中随着浸渍时间的延长，澄清度逐渐降低，C12澄清度最低(33.17%)，C0、E4、E8、E12以及E0的澄清度都在95%左右，表明果胶酶的添加对苹果酒的澄清有较好的效果，果胶酶能降解发酵液中果胶，降低发酵液黏度，促进酒液澄清。

2.2 香气成分分析

HP-SPME结合GC-MS分析苹果酒样品中挥发性组分结果显示，苹果酒香气组分出峰时间为3～23 min(图3)。共检测出51种香气成分(表2)，按结构可分为醇类、酯类、脂肪酸类、萜烯类、降异戊二烯类及其他类，其最主要为醇类(10种)、酯类(22种)和挥发酸类(9种)。可以看出，酯类物质最丰富，说明苹果酒是酯香为主，并富含醇香的果酒。

不同处理酒样检出的香气总数差异较明显，C4、C8、C12、C0、E4、E8和E12各酒样中香气物质数分别为35、37、37、28、24、26、36和32。可以看出浸渍处理后香气组分较果汁直接发酵更为丰富，能使得苹果酒香气更为富足。

图2 不同苹果酒样的澄清度Fig.2 Clarification of apple wines

图3 苹果酒样E4香气组分总离子流Fig.3 Total ion chromatogram of aroma compounds found in apple wine (sample E4)

2.2.1 醇类物质比较 酒中的醇类物质主要是在发酵过程中产生的，多为糖类和氨基酸经酵母代谢而成的产物。本试验共检测出醇类香气物质10种，各酒样中质量相对较高的5种为异戊醇、正己醇、苯乙醇、异丁醇和正辛醇。由表2可知，浸渍处理会增加酒体中的大多数醇香物质，但随着时间的延长以及果胶酶的添加，部分醇类物质质量浓度降低，但均高于清汁发酵的酒样。可见，适当时间的浸渍处理能在一定程度上促进醇类香气的释放，长时间浸渍处理并不能进一步增加醇香物质的质量浓度。

异戊醇作为醇类香气物质在4 d浸渍的酒样中质量浓度比其他酒样中高，在清汁发酵酒中质量浓度较低，作为酒中的高级醇，对酒的醇香丰满度起到很大的作用。具有花香气味的苯乙醇和果香香气的正己醇质量浓度仅次于异戊醇，浸渍处理会显著增加其质量浓度，但是随着浸渍时间延长，苯乙醇质量浓度却逐渐降低。果胶酶的添加能有效地减少杂醇油如异丁醇的生成，并能促进果汁中香气物质的释放。

浸渍处理产生的其他特有的香气如正庚醇、苯甲醇等都有果香和醇香气味，对苹果酒的风味丰满度上能起到一定的贡献，说明浸渍处理能有效地丰富苹果酒醇香香气。

2.2.2 酯类物质比较 测定结果表明C4、C8、C12、C0、E4、E8、E12和E0各酒样中酯类物质种类数分别为18、14、17、13、17、16、16和13。4 d浸渍处理酒样中酯类香气种类最丰富，清汁发酵苹果酒中种类最为贫乏。相比较而言，4 d浸渍处理的酒样C4和E4酯类香气质量浓度比其他酒样高，分别为1 945.66和1 638.11 μg/L。浸渍时间延长会降低酒中酯类香气的质量浓度，8和12 d浸渍处理的酒样中酯类香气质量浓度均低于清汁发酵酒(表2)。表明浸渍时间延长会降低酒中酯类香气的质量浓度。

苹果酒中主要酯类香气成分为乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯等。这些物质都散发怡人的果香及花香气味，是苹果酒的主体香气成分。由表2可知，浸渍处理会增加乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯的质量浓度，但是随着浸渍时间的延长，质量浓度却逐渐减少，表明短时间的浸渍会促进这些组分的释放，长时间浸渍处理可能导致其分解。而一些酯类化合物如2-甲基丁酸乙酯和苯乙酸乙酯的质量浓度则随浸渍时间延长而升高，可能是某些组分降解后再次合成所得。果胶酶的添加会降低苹果酒中部分酯类物质的质量浓度如乙酸乙酯和月癸酸乙酯等，而丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸丙酯、庚酸乙酯及辛酸乙酯受到的影响较小。这与Petropulos等[19]的研究结果相一致。

具有菠萝气味的己酸甲酯，富含苹果香味的2-甲基丁酸乙酯以及散发水果香味的庚酸乙酯、乙酸庚酯、辛酸甲酯等都是浸渍发酵产生的特有酯类香气物质，虽然质量浓度不高但是对苹果酒整体的风味能起到很好的修饰作用。

2.2.3 酸类物质比较 如表2所示，共检测出脂肪酸9种，同时从表2中发现，各酒样的脂肪酸种类为5～7种。酒样C0中挥发酸类物质质量浓度最高(1 273.28 μg/L)。酒样中最主要的酸类香气为止己酸、辛酸以及癸酸，前者带有奶酪香味，后两者一般有稍辛辣刺鼻的气味。与清汁发酵酒相比，辛酸和癸酸经短时的4 d浸渍后会减少，但随着浸渍时间的延长却略微增加。酯类物质的降解是酸类化合物的来源之一，表2中酸类物质总量的变化同酯类物质有相反趋势，从侧面证明苹果酒酿造过程中的酯和酸的转化过程。果胶酶的添加能明显减少酒中辛酸和癸酸的释放，对酒体风味起一定保护作用。具有水果香味的乙酰丙酸和2-甲基丁酸为浸渍发酵苹果酒特有，进一步证明浸渍处理对丰富苹果酒香气的积极作用。乙酸的质量浓度在清汁发酵酒中较高，可能是乙酸酯类降解或由乙醇氧化产生，侧面反映出清汁发酵酒的酒质不够稳定，易分解氧化。

表2 不同苹果酒样中香气成分组成Table 2 Aroma profiles of apple wines with different vinifications

(续表2 Continued table 2) %

注:nd.未检测出。

Note：nd.not detected.

2.2.4 萜烯及降异戊二烯类物质比较 萜烯类物质是植物次生代谢产物，和花卉及柠檬香气关联密切。降异戊二烯类物质是酒体中类胡萝卜素物质降解的产物，对酒体香气的丰富度有较大贡献。共检测到萜烯类物质2种，分别为香叶醇和香茅醇。大马酮是唯一检测到的降异戊二烯类物质，在酒样E4(18.75 μg/L)中质量浓度比其他酒样高，在C8(8.75 μg/L)中质量浓度最低，但是总体上各处理对其影响不大。

2.2.5 其他类物质 其他类物质共检测出7种，包括醛、酮、胺、肟以及呋喃等物质，这些物质大多对酒体的香气品质有消极影响。大多数浸渍发酵酒样中其他类物质质量浓度较之清汁发酵酒低，果胶酶的添加能减少这类物质的产生，表明浸渍处理和果胶酶处理对苹果酒的香气品质都有一定的保护作用。浸渍酒中未能检测出2-丁酮，可能浸渍处理促进其转化成其他物质。

2.2.6 主成分分析 用主成分分析不同方法生产苹果酒的香味组成，评价各参数对香气的影响。前2个主成分分别为PC1(51.58%)和PC2(33.14%)，共计84.72%。从图4可以看出，不添加酶的酒样多与主成分1呈正相关关系，而酶处理样则多与其成负相关。因此，主成分1主要和果胶酶处理有关，与果胶酶处理相关的主要香气组分为：正己醇(Al5)、乙酸丁酯(Es5)、癸酸乙酯 (Es20)、9-癸烯酸(Fa8)和间苯二胺(Ot2)等(图5)。

在图4的纵轴上，由上到下为4 d、8 d和12 d浸渍酒样，所以主成分2和浸渍时间有关，且浸渍时间长短和主成分2呈负相关关系。与浸渍时间相关的主要香气组分为：异戊醇 (Al3)、乙酸-3-甲基丁酯(Es7)、庚酸乙酯(Es13)、乙酸庚酯(Es14)以及2-甲基丁酸己酯(Es17)等，其中大多为浸渍发酵酒特有酯类香气物质。

图4 不同苹果酒得分Fig.4 Score plot of apple wines

图5 苹果酒中香气组分载荷图Fig.5 Loading plot of aroma profiles in apple wines

3 结 论

用HS-SPME和GC-MS联用对不同发酵工艺酿造的苹果酒香气进行分析，共检测出51种挥发性化合物，苹果酒的香气成分主要分为醇类、酯类和脂肪酸类3大类，以及少量的醛、酮、萜烯等物质。浸渍发酵和果胶酶处理均能丰富苹果酒香气种类，同时试验结果表明，短时浸渍能有效地增加苹果酒的香气种类和质量浓度，对苹果酒品质提升有很大帮助。果胶酶的添加能减少杂醇油和挥发酸的生成，同时能起到很好的澄清作用，所以经过4 d浸渍并添加果胶酶进行苹果酒酿造的工艺是比较优异的发酵工艺。

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(责任编辑：史亚歌 Responsible editor:SHI Yage)

Effect of Pectinase and Maceration Process on Aroma Composition of Apple Wine

CHENG Zhenggen,HUANG Jia,MIAO Zhuang, QI Yiman,FAN Mingtao and WEI Xinyuan

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To study effect of pectinase and maceration process on aroma profiles of apple wine,the aroma composition of apple wines obtained with different oenological procedures,including maceration time (4 days,8 days and 12 days) and addition of pectinase during the period of fermentation,were determined by HS-SPME-GC-MS.At the same time,clarity of wines were measured .The results showed that claritity of apple wines under pectinase treatment was about 95%,lower claritity of enzymatic was obtained in wines without pectinase,and the lowest clarity (33.17%) of C12 was presented.The main aroma compositions were alcohol,ester and fatty acid compounds.Alcohol aroma concentrations were higher in macerated wines,content of fusel oil decreased after enzymatic hydrolysis.Lower concentration of ester aroma were detected with longer maceration time,the highest concentration of ester aroma was obtained in macerated wine of 4 d.The highest and lowest concentrations of fatty acid aroma were presented in C0 (1 273.28 μg/L) and E4 (390.55 μg/L) respectively.So the process of apple wine fermentation with short time maceration of 4 days and addition of pectinase is beneficial for modifying aroma profiles of apple wine.

Aroma; Apple wine; Maceration; Pectinase; GC-MS

CHENG Zhenggen, male,master student.Research area:cider making.E-mail:18710920022@163.com

FAN Mingtao, male,professor,doctoral supervisor.Research area:food biotechnology.E-mail:fanmt@nwsuaf.edu.cn

2016-01-17

2016-03-01

农业部公益性行业专项(201503142-10)；陕西省统筹项目(2016KTCQ02-13)。

程拯艮，男，硕士生，研究方向为苹果酒酿造。E-mail：18710920022@163.com

樊明涛，男，教授，博士生导师，研究方向为食品生物技术。E-mail：fanmt@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-20

TS207.3

A

1004-1389(2017)01-0079-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1640.018.html

Received 2016-01-17 Returned 2016-03-01

Foundation item Special Fund of Public Agriculture Welfare of Ministry of Agriculture(No.201503142-10); Social Overall Project of Shaanxi Province (No.2016KTCQ02-13)