刺五加内生放线菌对5种苹果病原真菌的拮抗作用初探

刘爱华，徐红艳，王 彬，王 卫，周 波，袁丽杰

(1.华北理工大学 基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北唐山 063009； 2. 土肥资源高效利用国家工程实验室，山东农业大学 生命科学学院，山东泰安 271018)

刺五加内生放线菌对5种苹果病原真菌的拮抗作用初探

刘爱华1，徐红艳1，王 彬1，王 卫1，周 波2，袁丽杰1

(1.华北理工大学 基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北唐山 063009； 2. 土肥资源高效利用国家工程实验室，山东农业大学 生命科学学院，山东泰安 271018)

以苹果病原真菌尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌为靶标菌，采用皿内对峙培养法，对265株刺五加内生放线菌进行抗菌活性筛选。结果表明：供试的265株内生放线菌抗菌谱广，抗菌活性强，至少具有1种抗菌活性的菌株占菌株总数的51.0%。对层出镰刀菌和串珠镰刀菌具有抑制活性的菌株较多，分别占检测总菌株的38.9%和48.7%。对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌有抑制作用的菌株数量接近，分别占检测菌株总数的23.4%、31.7%、28.7%。对强活性菌株的PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、Helo、CYP功能基因筛选结果提示，菌株大多具有至少1种功能基因。10株强活性菌株系统发育分析表明，这些菌株都属于链霉菌属菌株。

刺五加；内生放线菌；苹果病原真菌；拮抗作用；生物防治

植物内生菌(Plant Endophyte)是指在其生活史中的某一段时期生活在健康植物组织内部，不引起植物组织明显侵染及症状改变的一类菌，包括真菌、细菌、放线菌[1]。植物内生菌广泛存在于不同植物中，因与植物各组织长期共生或寄生，而具有与其他生境中微生物不同的特性。1993年，美国蒙大拿州立大学的Stierle研究小组首次从短叶紫杉(Taxusbreviforlia)中分离得到1株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌新种安德氏紫杉霉菌(Taxomycesandreanae)[2]，由此掀起对药用植物内生菌研究的热潮。

中草药植物能产生丰富的药理活性物质，为与其共进化的内生菌创造一种独特生境，导致从中草药植物中分离的内生菌具有促生长、抑制病原菌，参与寄主某种化合物的合成，合成与宿主植物相同或相似活性成分等功能，而且产生新活性物质的几率比较大[3]。近年来，国外文献有报道从杜鹃花[4]、蛇藤[5]和卫矛科植物等分离到的内生放线菌产生新的抗菌化合物。国内赵珂[6]报道分离自攀西地区药用植物内生放线菌株对8种农业病害真菌都表现出较强的抑菌活性，远高于对普通细菌的抑菌活性。朱文勇等[7]报道分离自云南喜树内生放线菌对苹果炭疽菌、串珠镰孢菌等植物病害真菌表现出比对细菌更高的抗菌活性，筛选阳性率分别达到21.1%和26.7%。具有抗真菌活性的菌株远多于抗细菌的菌株。有研究显示[8]，在植物组织中内生病原真菌类群占优势。那么因植物内生放线菌具有更强的抗病原真菌的活性，使之能帮助宿主植物抵御病原真菌的危害，很好地印证其与宿主植物之间互惠互利的共生关系。同时植物内生放线菌在抵御植物真菌病害方面的优势也为寻找生物农药提供一条很好的思路。

苹果是中国的主要水果种类，也是北方果园的主要栽培树种。苹果的真菌性病害在中国广泛分布，严重影响果业生产安全[9]。在苹果病害的防治工作中，由于长期使用化学农药使植物病原真菌产生很强的抗药性[10-11]。不但化学农药的防治效果越来越差，而且大量农药残留还可能造成果品及环境污染。随着人们对水果品质的要求不断提高，生物防治作为安全、有效的手段已逐步应用到真菌病害防治中。因此，寻找和研制生物农药逐渐代替化学农药是防治苹果真菌病害的重要途径之一[12-13]。

为此，华北理工大学微生物分离鉴定及代谢产物研究课题组检测菌种库中265株刺五加(Acanthopanaxsenticosus)内生放线菌对5种苹果病原真菌的拮抗作用，旨在筛选具有明显抑菌作用的刺五加内生放线菌菌株，为进一步应用研究奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 刺五加内生放线菌 试验内生放线菌为实验室菌种库中保存的从辽宁省本溪市、吉林省梅河口市、吉林省柳河县、黑龙江省穆棱市、河北省兴隆县(雾灵山)5个地区刺五加的根、根茎、茎、叶中分离得到的265株内生放线菌。

1.1.2 抗菌试验指示病原真菌 尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)、串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)菌株均由土肥资源高效利用国家实验室保存。

1.1.3 培养基及主要试剂 ISP2固体琼脂平板培养基：酵母膏4.0 g，葡萄糖4.0 g，麦芽膏10.0 g，微量盐0.5 mL，复合VB 少许，琼脂15.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；PDA平板培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15.0 g，去离子水1 000 mL，pH自然。

PCR扩增引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，BOX-PCR和功能基因检测的试剂均购于全式金生物技术有限公司，16S rRNA基因序列测定的试剂由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 抗菌活性检测 将ISP2培养基上生长良好的内生放线菌，用直径0.5 cm打孔器制成小圆片，倒置于距离培养皿中心3 cm的PDA平板四周，28 ℃培养3 d。在培养病原真菌的PDA平板上同样也用0.5 cm打孔器取菌片，放置于PDA平板中心，于28 ℃培养3 d，测定供试菌株的抑菌圈大小，每个处理重复3次。

1.2.2 菌株功能基因选择与检测 DNA的提取参照袁丽杰等[14]的方法。PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、Helo、CYP[15]化合物合成基因的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应程序参照文献[16] 进行。产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，电压为100 V。

1.2.3 活性菌株初步分析 细菌基因组DNA提取、16SrRNA基因序列扩增及序列测定参照袁丽杰等[14]的方法进行。PCR产物测序由大连宝生物生物技术公司完成。挑选形态差异较大及活性较强的菌株进行16S rRNA基因序列测定。依测序结果，用 Blaste程序从GenBank、ezbiocloud数据库中进行相关菌株16S rRNA基因序列比对，系统进化距离矩阵根据Kimum模型估算，用MEGA4软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建。同时，重复取样1 000次自展值(bootstrap value)分析评估系统进化树的拓扑结构的稳定性。

2 结果与分析

2.1 活性筛选结果

供试的265株内生放线菌对5株苹果病原真菌均有不同程度的抗性(表1)，抗菌谱广，抗菌活性强，至少具有1种抗菌活性的菌株占菌株总数的51.0%。对层出镰刀菌和串珠镰刀菌具有抑制活性的菌株较多，分别占检测总菌株的38.9%和48.7%。其中对层出镰刀菌具有较强抑菌活性(抑菌圈直径≥21 mm)的菌株有26株，占该病原菌拮抗菌株总数的25.2%；对串珠镰刀菌具有较强抑菌活性的菌株有27株，占拮抗菌数的20.9%。对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌有抑制作用的菌株数量接近，分别占检测菌株总数的23.4%、31.7%、28.7 %。其中对尖孢镰刀菌具有较强抑菌活性的菌株有18株，占拮抗菌数的29%；对腐皮镰刀菌具有较强抑菌活性的菌株有9株，占拮抗菌数的10.7%；对立枯丝核菌具有较强抑菌活性的菌株有41株，占拮抗菌数的53.9%。立枯丝核菌的拮抗菌株虽然只占检测菌株总数的28.7%，但其中抑菌活性较强的菌株占到一半以上。

265株检测菌株中有31株菌对5种病原真菌均具有强度不等的抑制活性(表2)。其中菌株13-107、13-253、13-254、13-258对5种病原菌的抑制活性均较强，抑菌圈直径均不小于21 mm。菌株13-123、13-181、13-251、13-252、13-292对其中的4种苹果病原真菌具有拮抗活性，且大多活性作用较强。这些筛选结果为菌株进一步开发利用和寻找抗菌活性物质提供良好的研究材料和基础。

表1 内生放线菌对5种病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibition effect of endophytic actinomycetes on five pathogenic fungi

注：抑菌强度中的+表示活性较弱，抑菌圈直径<10 mm； ++表示活性中等，抑菌圈直径为11～15 mm；+++表示活性中等，抑菌圈直径表示为16～20 mm；++++表示活性较强，抑菌圈直径表示21～25 mm；+++++.表示活性较强，抑菌圈直径>25 mm。下表同。

Note:+.Weak antimicrobial activities with <10 mm diameter of inhibition zone； ++.Medium antimicrobial activities with 11-15 mm diameter of inhibition zone；+++.Medium antimicrobial activities with 16-20 mm diameter of inhibition zone；++++.Strong antimicrobial activities with 21-25 mm diameter of inhibition zone；+++++.Stronger antimicrobial activities with >25 mm diameter of inhibition zone. The same hereinafter.

表2 拮抗活性较广及活性较强的菌株活性及其功能基因检测Table 2 Activities and the functional genes of strains having wide and better antagonism activities

2.2 较强活性菌株相关功能基因的检测结果

分别利用PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、CYP及Helo基因片段扩增引物，对39株具有较强抗苹果病原真菌活性的菌株相关次级代谢产物合成基因进行检测(表2)。结果表明，39株供试菌株中至少有30株扩增出1种合成酶基因，其中扩增出PKSⅡ基因的菌株数最多(17株)。扩增结果显示，菌株13-252的PKSⅠ、PKSⅡ、CYP及Helo4种功能基因都具备，菌株13-211、13-123均同时扩增出PKSⅠ、PKSⅡ、CYP3种功能基因。此检测结果提示有抗菌活性的菌株大多都能检测到功能基因。但在检测中发现，抗菌活性很强的菌株13-178、13-253、13-256及其他6株具有较好活性的菌株，未检测到这5种编码天然活性产物的相关基因。

2.3 活性菌株初步鉴定

依据抗菌活性及菌株形态选取10株菌株进行初步鉴定。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明，选取的10株强活性菌株都属于链霉菌属(Streptomyces)。由16S rRNA基因序列构建的N-J系统发育树显示(图1)，10株链霉菌分成4簇，与链霉菌属标准菌株的亲缘关系远近从98.62%至100%不等。大部分菌株与其系统发育关系最密切的典型菌株之间存在一定的遗传差异。

节点处的数字代表用邻接法分析时，在1 000次重复检验中大于50%的自展值。括号中的数字是GenBank中菌株16SrRNA基因登记的序列号。

The numbers at the nodes indicate the bootstrap values (>50%) based on neighbour-joining analyses of 1 000 resampled data sets. Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank.

图1 根据16S rRNA 基因序列构建部分菌株系统进化树
Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationships among reference strains and experimental trains based on 16S rRNA gene sequences

3 讨 论

中国是目前世界上最大的苹果生产国家，2013年统计数据显示，国内的苹果种植面积已达到222.15万hm2，大约10 a后，将有大批果园进入更新改建期，由于耕地的缺乏，大多都是原地换茬植树，因此连作障碍已成为苹果生产上的重要问题。大量试验表明，生物因素是产生再植病害最直接和最主要的原因。长期再植使土壤微生物群落组成发生变化，从而抑制苹果树的生长。目前，河北已成为中国主要的苹果产区之一。河北省不同地区果园再植土的病原真菌数量有很大的差异，不同地区的优势种群也存在一定的差异，但镰刀菌属和丝核菌属无论在哪个地区分离频率都是最高的，已成为苹果连作障碍的主要病原真菌[17]。

生物防治就是利用天然拮抗微生物或其代谢产物对抗植物病害的防治措施。宋光桃等[18]从植物根际分离筛选到1株抗油茶炭疽病菌的拮抗链霉菌F10。曾羽澈等分离到1株土壤中的放线菌ZM-16，对姜瘟的病害菌青枯假单胞菌具有明显抑制作用。龙建友等[19-20]从秦岭山区分离到1株链霉菌，其发酵液对10余种常见的农作物病原真菌具有良好的杀菌活性，并已申请专利。可见，使用生防菌剂逐步替代造成严重环境问题的化肥和农药的防治措施，已越来越受到各国学者的关注和重视，并将成为未来的发展方向。

天然活性产物的主要来源是放线菌。目前，约2/3的抗生素是由放线菌产生，尤其是其中的链霉菌属所产生的[21]，很早就被人类用于制造抗真菌、抗细菌、抗肿瘤的各类抗生素。进而人们又从中挖掘出农业抗菌剂、杀虫和除草剂、植物生长调节剂等多种产品，在医学、农业病虫害和环境保护中起到重要作用。因而在放线菌中寻找并分离新型农用抗生素是极具潜力的。链霉菌属的菌株不仅广泛分布于土壤的腐生环境中[22]，植物内部也蕴藏有相当丰富的资源[23]。从本次筛选活性结果来看，供试的265株刺五加内生放线菌对5株苹果病原真菌均有不同程度的抗性，抗菌谱广，抗菌活性强，至少具有1种抗菌活性的占菌株总数的51.0%。同时，经16S rRNA基因序列检测进行菌株初步鉴定显示，抗菌活性强的菌株均为链霉菌属菌株，与文献报道相符。

目前，已有的基因组研究表明，一个菌株的基因组决定其次级代谢产物的产生潜能，因此，采用特定基因片段进行分子筛选，可充分揭示菌株合成代谢产物产生潜能，预测产物结构类型以利于后期活性产物的分离提取。本试验中检测的几种功能基因是放线菌中常见的较重要的次级代谢产物合成相关基因，分别负责编码产生非核糖体聚肽类化合物、聚酮类化合物、含卤素成分化合物及多烯类化合物等。目前，已知的聚酮类化合物由PKSⅠ、PKSⅡ基因控制合成，已超过1 000种，具有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗病原生物和免疫抑制等生物活性，且已广泛应用于医药、农业、畜牧业等，具有重要开发价值。非核糖体含硫多肽类抗生素是多肽类抗生素的一个重要家族，由NRPS基因指导合成，具有较强抗菌活性。多烯类化合物是由CYP基因合成的重要药物先导化合物，主要对真菌具有抑制作用[24]。本研究中强活性菌株功能基因的检测结果提示，这些菌株具有产生多种活性化合物的潜能，是筛选天然产物或研制生防菌剂的重要菌源。但在试验中发现有9株活性较好的菌株未检测到这些功能基因，可能与扩增体系、条件及引物等有关。也可能这些菌株具有未检测到的其他功能基因。

本试验只是刺五加内生放线菌室内抑菌活性的初步结果，对于其中活性强、有潜力的菌株，还需进一步进行活体接种和大田试验来验证其抑菌作用。本研究所得初步结果可为这些菌株的实际应用奠定一定基础，也为明确刺五加内生放线菌在防控苹果病害发生和流行中的潜力提供更为详实的依据。

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(责任编辑：潘学燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Antagonism of Endophytic Actinomycetes Isolated fromAcanthopanaxsenticosusto Five Apple Pathogenic Fungi

LIU Aihua1, XU Hongyan1, WANG Bin1, WANG Wei1, ZHOU Bo2and YUAN Lijie1

(1.Hebei Province Key Laboratory on Chronic Diseases/Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063009, China; 2.National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian Shandong 271018, China)

Using Petri dish confront culture method, the activities of 265 strains of endophytic actinomycetes isolated fromAcanthopanaxsenticosuswere screened withFusariumoxysporum,Fusariumproliferatum,Fusariummoniliforme,Fusariumsolani, andRhizoctoniasolani.These strains displayed a strong anti-fungi activity and a wide spectrum, 51.0% of total showed at least one kind of anti-fungi activity. 38.9% and 48.7% of total strains indicated more inhibitory activity toFusariumsolaniandFusariummoniliforme. 23.4%, 31.7% and 28.7% of the total strains showed inhibition toFusariumoxysporum,Fusariumsolani,Rhizoctoniasolanirespectively. The functional genes screening forPKSⅠ,PKSⅡ,NRPS,Helo,CYPsuggested that the strong active strains had at least one active metabolites synthase gene. Strains were analyzed phylogenetic diversity and showed that these strains belong to the genusStreptomyces.

Endophytic actinomycetes；Apple pathogenic fungi；Antagonistic effect；Biological control

LIU Aihua, female, master postgraduate.Research area:the isolation, identification and activity of actinomycetes.E-mail：643961437@qq.com

YUAN Lijie, female,Ph.D,professor,master supervisor.Research area:the isolation, identification and activity of actinomycetes. E-mail：yuanlijie1970@163.com

2015-09-20

2016-01-22

河北省自然科学基金(C2014209137)；“十二五”国家科技支撑计划(2011BAD11B01)。

刘爱华，女，学士，研究方向为微生物分离鉴定及次级代谢产物。E-mail：643961437@qq.com

袁丽杰，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为微生物分离鉴定及次级代谢产物。E-mail：yuanlijie1970@163.com 周 波，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为微生物资源与功能型生物肥料。E-mail：zhoubo2798@163.com

日期：2016-12-20

Q939.96

A

1004-1389(2017)01-0094-07

ZHOU Bo, male, Ph.D,professor,master supervisor.Research area:the microbial resources and biological fertilizer.E-mail：zhoubo2798@163.com

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.024.html

Received 2015-09-20 Returned 2016-01-22

Foundation item Natural Science Foundation of Hebei Province(No.C2014209137); Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period (No.2011BAD11B01).