多孢木霉HZ-31菌株发酵条件研究

朱海霞，马永强，魏有海，郭青云

(青海省农林科学院/农业部西宁作物有害生物科学观测实验站/青海省农业有害生物综合治理重点实验室，西宁 810016)

多孢木霉HZ-31菌株发酵条件研究

朱海霞，马永强，魏有海，郭青云

(青海省农林科学院/农业部西宁作物有害生物科学观测实验站/青海省农业有害生物综合治理重点实验室，西宁 810016)

选用高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株为对象，研究该菌株最适碳源、氮源、固态发酵基质的筛选、固-液发酵条件的优化。结果表明：HZ-31最适碳、氮源为小麦粉，最适氮源为(NH4)2SO4，在PDA培养基上产孢量达6.17×108mL-1，最适碳氮源培养基上产孢量达到4.45×109mL-1。HZ-31最佳产孢的固态基质为麦秆糠，适宜的接种量是体积分数为40%。正交优化培养试验条件得出该菌最适培养基质含水量为37%，最适温度为23 ℃，发酵最适时间为8 d。

多孢木霉HZ-31；固态发酵基质；固-液发酵条件

菌株HZ-31分离于自然感病的大刺儿菜，由青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室提供保存。前期研究结果显示，该菌株在PDA平板上培养7 d后，表面产生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或垫状的疱状物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4个轮生，直角，分生孢子长椭圆形或球形，光滑，结合形态特征和分子鉴定结果，判断菌株HZ-31为多孢木霉(Trichodermapolysporum)。离体条件下测定其对禾本科杂草野燕麦种子萌发的影响，结果表明经该菌发酵滤液处理后，野燕麦种子发芽率为0，菌株对种子萌发抑制率达100%；喷施于盆栽野燕麦叶片后可导致叶片发黄枯萎甚至整株枯死，接种5 d后对野燕麦的发病率和病情指数分别达到90.0%和82.0。同时，该菌株对藜、猪殃殃等农田阔叶杂草亦表现出不同程度的除草活性，且对青海省主栽作物小麦(TriticumaestivumL.)、蚕豆(ViciafabaL.)、豌豆(PisumsativumL.)安全性评价结果表现为安全[1]。生防菌株HZ-31具有开发成为小麦、蚕豆、豌豆田真菌除草剂的潜力。

碳氮源、基质含水量、培养时间、培养温度等因素是发酵过程中重要的检测和控制参数，可直接影响到菌体生长和产物合成[2]。对菌株HZ-31的发酵生产工艺来说，明确各因素与菌株发酵生产之间的关系，将为该菌的规模化生产和剂型研究提供理论依据。因此，本研究运用单因素法确定生防菌株最适碳、氮源和固态发酵基质，正交试验开展最佳基质组合筛选和菌株培养条件的优化试验，明确固液发酵条件与菌株发酵生产之间的关系，为该菌的大规模生产提供必要的工艺参数，控制并改进发酵工艺条件，使其大量繁殖，为实现生物菌剂的产业化生产及进一步的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

HZ-31多孢木霉(Trichodermapolysporum)分离于自然感病的大刺儿菜，由青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室提供保存。

1.2 试验设计

1.2.1 最适碳、氮源的确定 以PDA培养基作为基础培养基进行碳氮源单因素试验，用等质量的玉米粉(C1)、小麦粉(C2)、蔗糖(C3)、葡萄糖(C4)作为碳源。氮源KNO3(N1)、大豆粉(N2)、酵母膏(N3)、(NH4)2SO4(N4)为氮源，按照质量分数为2%的添加量，将各碳氮源添加到基础培养基中，配制成不同的碳氮源培养基[2-4]，取经活化直径8 mm的菌饼作为接种体接入皿中。以不添加碳氮源的基质作为对照，每处理重复3个。血球计数法统计产孢量，同时用分光光度计在600 nm波长内测孢子悬浮液OD吸光值，确定筛选效果[5]。

1.2.2 固态发酵基质筛选 选用菜籽饼、麦秆糠、羊粪、麦麸、珍珠岩和蛭石作为基质[4-5]。将不同基质500 g高温灭菌后放入白塑料盘中，接种菌液后20 ℃室内培养，观察记录菌落生长状况；用分光光度计测其OD吸光值，确定产孢量高的底物基质。每处理设3个重复。

1.2.3 最适接菌量的确定 以菜籽饼作为底物，混合营养物质加入150 mL三角瓶，每个处理加入无菌水20 mL，接基质体积分数的10%、20%、40%、60%、80%、100%比例将孢子悬浮液接入培养基中充分混匀培养，用血球计数板计数确定产孢量最高的接菌量。每个处理重复3个。

1.2.4 培养基含水量对产孢量影响 称25 g菜籽饼基质装入150 mL三角瓶，加入基础培养基营养物质混匀，按基质体积百分比分别加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸馏水[6]，培养基灭菌后接种对应的菌株，在恒温培养箱25 ℃培养菌落，观察菌丝生长状况，第7天测孢子悬浮液的OD值，结合菌丝生长状况，得出适合该菌生长的培养基含水量范围。每个处理重复3个。

1.2.5 培养温度对产孢量的影响 称取25 g菜籽饼作为基质装入150 mL三角瓶，加入各菌对应的基础培养基 II营养物质混匀，按基质体积百分比加水40 mL，灭菌接入相应的菌种后，分别在恒温箱中以15、20、25、30、35 ℃恒温培养，7 d后测孢子悬浮液的OD值，结合菌丝生长状况，得出适合该菌生长的培养温度范围[3]。每个处理设3个重复。

1.2.6 二次正交旋转组合设计 通过单因素试验筛选出培养基含水量和培养温度，再结合培养时间这3个量作为因素，分别取5个水平，采用二次正交旋转组合设计，在三角瓶中进行正交试验，确定3株菌的最优培养条件[7]。每个处理重复3个。HZ-31培养条件二次正交旋转组合设计变量水平及编码见表1。

表1 HZ-31培养条件二次正交旋转组合设计变量水平及编码Table 1 Table of orthogonal test of culture conditions of HZ-31

1.3 数据处理

所有数据均采用DPS 6.50进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 HZ-31菌株碳氮源筛选

用血球计数法和分光光度计法测产孢量及其OD值。对HZ-31在不同碳氮源培养基的产孢量进行计数并对菌悬液的OD值进行测定，结果见表2。由表2可以看出，HZ-31在PDA培养基上产孢量为6.17×108mL-1；在C2培养基上产孢量最高(3.03×109mL-1)，孢子悬浮液的OD值与其他碳源之间存在极显著性差异；在N4培养基上产孢量最高达7.53×108mL-1，且其OD值与其他氮源OD值之间存在极显著性差异；将C2和N4结合制成最佳培养基，产孢量达到4.45×109mL-1，最适碳氮源培养基的产孢量和OD值与其他单一碳氮源之间存在显著性差异。

结合菌落形态、菌丝生长情况、产孢量和OD值，最终筛选结果：HZ-31最适碳源为小麦粉；最适氮源为(NH4)2SO4。

2.2 HZ-31菌株固态基质筛选

在不同的固态发酵基质中加入适量的无菌水，用小喷壶将过滤的菌种发酵液均匀喷洒在基质上拌匀，用保鲜膜封口，25 ℃培养。观察菌落生长情况，使用分光光度计法测定过滤孢子悬浮液OD值，确定不同基质的产孢量。结果分析可知，HZ-31在麦秆糠上生长较好，菌落较大，菌丝生长旺盛。为进一步验证该菌在米糠中生长优于其他条件，设计试验见表3。

表2 HZ-31在不同碳氮源培养基的产孢数量及菌悬液OD值Table 2 Spore production quantity and OD of HZ-31 on culture medium of different carbon and nitrogen sources

注：不同大写字母表示在0.01 水平上差异显著，不同小写字母表示在 0.05水平上差异显著，下表同。

Note:Different uppercase letters in column indicate very significant difference(P<0.01), the different lowercase letters in column indicate significant difference(P<0.05),the same as below.

结合前面孢子悬浮液孢子浓度和分光光度值存在正比关系，由表3可以看出：HZ-31生长较好的固态基质为麦秆糠>珍珠岩>麦麸>羊粪>菜籽饼>蛭石；麦秆糠和其他基质之间存在极显著性差异，羊粪和珍珠岩、菜籽饼、蛭石之间存在显著性差异，菜籽饼和蛭石之间也存在极显著性差异。HZ-31最适产孢的固态基质为麦秆糠(图1，图2)。

2.3 HZ-31菌株发酵最适接菌量

由表4可以看出，HZ-31在接种量约为体积分数为40%时，产孢子量达到108，过高或过低的接种量均导致产孢量下降，菌落长势不好。由此得知，HZ-31的最适接种量约为体积分数为40%。接种量过低，基质中孢子含量太少，菌体生长菌落少，不能铺满基质，容易导致污染，且会延长其生长时间，培养基容易被杂菌污染；而接种量过多则会造成固体基质含水量过多，含水量多容易引起细菌污染，且对于好氧菌来说，基质透气性变差，这样会阻碍菌体在固体发酵基质中的生长。

表3 菌株在不同固态基质的孢子液吸光值差异显著性分析Table 3 Analysis of significant difference on spore liquid absorbance value in different solid substrates

图1 不同底物基质的筛选过程Fig.1 Selection of different solid substrates

接种量Inoculationdose10%20%40%60%80%100%产孢量/(g/mL)Sporeproduction1．31×1061．53×1072．14×1083．27×1071．84×1064．38×105

2.4 HZ-31菌株培养条件正交优化试验

固态基质含水量对产孢量影响的试验结果表明，HZ-31菌株在培养基含水量60%～100%，菌落长势较好。

该菌的生长温度范围均在20～35 ℃。为下一步的正交试验提供最低和最高温度标准。培养时间范围为3～14 d，14 d后生长基本处于很缓慢的状态。

通过单因素试验筛选出培养基含水量和培养温度后结合培养时间作为3个因素，分别取5个水平，在150 mL三角瓶中加入适合的基质进行正交试验，确定该菌株的最优培养条件。每个处理设3个重复。

在DPS 6.50数理统计分析软件上进行数据处理和统计分析，利用二次回归正交旋转组合试验设计建立二次回归模型并对其进行方差分析，进而通过数据优化程序对其固态发酵培养条件优化。

利用DPS 6.50数据处理系统对试验结果(表5)进行分析，得到HZ-31菌株的培养基含水量(X1)、培养温度(X2)、培养时间(X3)与菌株产孢量(Y)的数学模型回归方程为:

Y=8.829 54-1.434 51X1-1.228 82X2-0.018 97X3-0.408 61X12-0.267 19X22-0.779 84X32-0.062 50X1X+20.587 50X1X3+0.412 50X2X3

从回归方程可看出，培养基含水量(X1)均系数较大，对HZ-31产孢量Y值的影响较大，起主要效应作用；培养时间(X3)系数最小对产孢量Y值的影响最小；3因素的频率分布95%分布区间均在一定范围内呈正态分布；分析X1X2、X1X3和X2X3的互作效应可忽略不计。

根据DPS上的处理结果得固态发酵的最适培养条件，HZ-31最适培养基质含水量为37%；最适培养温度为23 ℃；最佳培养时间为8 d。

3 讨 论

从青海省独特的气候生态条件下筛选出具有强除草活性的生防菌株HZ-31，前期研究发现其对禾本科及几种阔叶杂草具有较强致病性，本研究采用单因素法筛选出合适的碳氮源、适宜的固态发酵基质及最适接种量，同时运用正交试验开展菌株培养条件的优化试验，确定该菌株各项技术工艺参数指标，旨在获得一株发酵时间适中、产孢量高的优良菌种，为该菌株的规模化生产发展提供依据。

研究表明，碳氮源、发酵时间、接种量、培养时间等因素对菌株HZ-31分生孢子的生产均有明显的影响。HZ-31最适碳源为小麦粉，最适氮源为(NH4)2SO4，在PDA培养基上产孢量达到6.17×108mL-1时，最适碳源培养基上产孢量达到3.03×109mL，最适氮源培养基上产孢量达到7.53×108mL-1。小麦粉和(NH4)2SO4分别作为补充碳氮源，优化了固态培养基，促进了菌株的产孢量。固态发酵需要有合适的接种量，而发酵液接种量的多少与菌株的生长周期有关。本研究中HZ-31最适宜的接种量是体积分数为40%。如果接种量过大，菌体生长过快，就会造成溶解氧不足或者营养成分的过度消耗，不利于发酵产物的累积。如果接种量过小，则会延长培养周期，产孢量减少，杂菌污染的可能性也更大。另外，通过正交试验筛选出该菌株最适培养基质含水量均为37%，最适培养温度为23 ℃，最佳培养时间为8 d。对于菌株HZ-31的发酵生产工艺来说,明确各因素与菌株发酵生产之间的关系, 将为该菌的规模化生产和剂型研究提供理论依据。

表5 正交旋转组合设计试验方案及结果Table 5 Scheme and results of design experiment of quadratic orthogonal rotation

生防菌的固态发酵基质的选取一般都是价格低廉、容易获得的农副产品下脚料，既节约了生产成本，又符合现代可持续发展战略[8]。本研究中筛选出的生防菌株HZ-31最适产孢固态基质麦秆糠，更适用于大批量生产，方便菌剂储存和运输。除了以上生防菌剂固态发酵的影响因素之外，适宜的助剂在很大程度上也影响制剂的生物活性和稳定性，因此，下一步有必要对该菌的载体助剂进行筛选，为该菌株剂型的制备提供基础。

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[2] 刘 东,黄志立.发酵工程[M].北京：高等教育出版社,2015:8.

LIU D,HUANG ZH L.Engineering of Fermentation [M].Beijing:Higher Education Press,2015:8(in Chinese).

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(责任编辑：史亚歌 Responsible editor:SHI Yage)

Study on Culture Conditions ofTrichodermapolysporumHZ-31

ZHU Haixia, MA Yongqiang,WEI Youhai and GUO Qingyun

(Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining, Ministry of Agriculture of P.R.China/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province,Xining 810016，China)

The potential bioherbicide strainsTrichodermapolysporumHZ-31 can cause high virulence to weeds, we selectedTrichodermapolysporumHZ-31 as potential strain to study the optimum carbon, nitrogen sources, optimum solid substrate, optimization of culture conditions.The results showed that the optimal carbon is wheat flour,the optimum nitrogen is (NH4)2SO4for HZ-31,the number of spore production on optimum carbon and nitrogen culture medium was 4.45×109mL-1, and was 6.17 ×108mL-1on PDA . The optimum substrate was wheat bran,the optimum inoculum was 40% volume fraction,the orthogonal test showed that the optimum initial moisture content of HZ-31 was 37%, the optimal temperature was 23 ℃ and the optimal cultural time was 8 d.

TrichodermapolysporumHZ-31;Soild substrate;Soild-liquid culture conditions

ZHU Haixia,female, associate research fellow.Research area:biological control of weeds. E-mail：zhuhaixia0101@163.com

GUO Qingyun, female, research fellow. Research area:integrated management of farmland weeds. E-mail：guoqingyunqh@163.com

2015-07-22

2015-08-27

国家自然科学基金(31560518)；青海省农科院“高原特色作物生物技术育种”团队创新能力提升专项(2014- NKY-206)。

朱海霞，女，副研究员，主要从事杂草生物防治研究。E-mail：zhuhaixia0101@163.com

郭青云，女，研究员，主要从事农田杂草综合治理研究。E-mail：guoqingyunqh@163.com

日期：2016-12-20

S451.1

A

1004-1389(2017)01-0132-05

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.032.html

Received 2015-07-22 Returned 2015-08-27

Foundation item National Natural Science Foundation of China(No.31560518);Special Fund for Innovation Promotion of Research Team in “Biotechnology Breeding for Special Crops in Tibet and Qinghai Plateau” ，Qinghai Academy of Agricultural and Forest Sciences (No.2014- NKY-206).