温郁金根腐病病原菌生物学特性及杀菌剂筛选

时间：2024-05-25

陈旭玉，钟锦玲，贺春萍，黄娴，甘炳春

(1.中国医学科学院﹠北京协和医学院，药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室)，海南万宁 571533； 2.中国医学科学院﹠北京协和医学院，药用植物研究所，北京 100193；3.岭南师范学院，广东湛江 524048； 4.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所(农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室)，海口 571101；5.海南碧凯医药研究所，海口 570216)

陈旭玉1,2，钟锦玲3，贺春萍4，黄娴5，甘炳春1

旨在对温郁金根腐病病原菌进行生物学特性研究及杀菌剂筛选。采用平板培养法测定和平板对峙法进行病原菌生物学特性研究和药剂筛选。结果发现温郁金根腐病病原菌最适培养基是查氏琼脂培养基，最适温度为28 ℃，碳源和pH对其生长影响不大，最适氮源为牛肉浸膏。杀菌剂筛选结果表明，430 g/L戊唑醇SC和w=50%的咪鲜胺锰盐WP的抑制效果较强，其EC50分别为0.002 和0.024 g/L，其次为w=50%多菌灵WP和w=10%苯醚甲环唑WG，EC50分别为2.225和2.646 g/L。430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鲜胺锰盐WP、w=50%多菌灵WP和w=10%苯醚甲环唑WG均可有效抑制温郁金根腐病菌的生长，可进一步用于田间试验。

温郁金；根腐病；病原菌；生物学特性；杀菌剂筛选

温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling系姜科(Zingiberaceae)姜黄属(CurcumaL.)植物[1]，为温州市著名的道地药材，具有利胆保肝、清心解郁之功效[2-3]。温郁金是海南保妇康栓的主要植物材料，年销售2亿以上，但温郁金根腐病严重，影响其产量和质量。温郁金根腐病主要发生在根茎部，严重时根茎无法吸收和输送营养和水分，最终导致整株枯死。温郁金引种至海南种植6月开始发病，7月达到高峰，连作严重的地块发病率达50%[4]。如果能找到根腐病的病原菌和防治方法，对提高温郁金产量和质量有重要意义。温郁金栽培种植过程中用w=50%退特灵、w=50%甲基托布津、w=70%代森锰锌或w=75%百菌清对根腐病初步防治[5-6]，但没有对温郁金根腐病病原菌、生物学特性及药剂筛选进行深入研究。本文通过温郁金根腐病病原菌的分离和鉴定、生物学特性及药剂筛选研究，以期进一步明确温郁金根腐病病原菌、病原菌生物学特性并筛选出较好的药剂，为病害的大田防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株温郁金根腐病病原菌由中国医学科学院药用植物研究所海南分所分离鉴定并保存，备用。

1.1.2 供试杀菌剂采用生长速率法进行初步的质量浓度筛选，在预试验的基础上，确定各药剂的最低抑制质量浓度，以此为依据配制5个质量浓度梯度的含毒马铃薯琼脂培养基(PDA)平板。杀菌剂种类、厂家及供试质量浓度范围见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 生物学特性研究不同培养基、温度、pH、碳源及氮源对菌丝生长的影响参照文献[7]进行。

1.2.2 室内毒力测定将菌饼接入不同药剂处理的含毒平板培养基中，每个质量浓度3个重复，不加药剂的PDA作为对照。在28 ℃的恒温培养箱中培养，7 d后用十字交叉法测量菌落生长直径，并计算每个处理菌落的平均值及抑菌率。

表1 不同药剂质量浓度Table 1 Different of fungicides and mass concentration g/L

1.3 统计分析

将菌丝生长抑制率换算成机率值(y)，杀菌剂质量浓度(g/L)转换成以10为底的对数值(x)，以抑制机率值为纵坐标，以对数值为横坐标，作毒力回归直线，求出毒力回归方程(y=ax+b)，相关系数(r2)和抑制有效质量浓度(EC50)，以表示杀菌剂对温郁金根腐病菌抑制作用的强弱，应用Excel软件求出各药剂毒力回归方程、EC50值和相关系数。

2 结果与分析

2.1 温郁金根腐病的症状及病原菌分离鉴定

温郁金根腐病主要发生在根茎部，严重时根茎部腐烂导致无法吸收和输送营养和水分，造成地上部叶片大量干枯，导致整株死亡。病原菌分离后，将菌株进行DNA提取，引物为ITS1 (5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 进行PCR扩增测序，测序序列比对后发现该菌株与Fusariumproliferatum(KM592959, EU151488, HF930594)的序列相似性为99%。结合形态学鉴定的结果，将菌株确定为层出镰孢菌(F.proliferatum)。

2.2 层出镰孢菌的生物学特性

2.2.1 不同培养基对层出镰孢菌菌丝生长的影响层出镰孢菌(F.proliferatum)在燕麦琼脂培养基(OA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、PDA、胡萝卜琼脂培养基(CA)、查式琼脂培养基(CZ)上均能很好的生长，但在CZ培养基上生长速度最快，其次为CA培养基(图1)。

图1 菌丝在不同培养基上生长的结果Fig.1 Results of mycelia growth on different medium

2.2.2 不同温度对镰孢菌菌丝生长的影响镰孢菌(F.proliferatum)菌丝在15～35 ℃均能生长，适宜温度为28～30 ℃，最适温度为28 ℃，35 ℃时菌丝生长明显受到抑制，40 ℃时菌丝停止生长(图2)。

2.2.3 不同pH对镰孢菌菌丝生长的影响镰孢菌(F.proliferatum)菌丝对酸碱度的适宜范围很广，菌丝在pH为7～11均能生长，当pH<5时，菌丝生长受到明显抑制。说明适宜温郁金根腐病病原菌生长的环境为偏碱性，过酸对病原菌的生长不利(图3)。

图2 菌丝在不同温度下生长的结果Fig.2 Rresults of mycelia growth on different temperatures

图3 菌丝在不同的pH生长的结果Fig.3 Results of mycelia growth on pH

2.2.4 不同碳源对菌丝生长的影响不同碳源对镰孢菌菌丝的生长影响不大，适宜碳源为D-山梨醇、葡萄糖和乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉(图4)。

2.2.5 不同氮源对菌丝生长的影响不同氮源对镰孢菌菌丝生长的影响有差异，最适氮源为牛肉浸膏，镰孢菌在含有硫酸铵和硝酸铵的培养基中生长缓慢(图5)。

2.3 室内抑菌效果测定

2.3.1 供试杀菌剂对温郁金根腐病菌丝生长的影响由表2可知，随着各种杀菌剂质量浓度的增加，病菌抑制率增大，说明药剂质量浓度与抑制率成正相关。8 种杀菌剂中，在较低的质量浓度下，即1 g /L，w=50%咪鲜胺锰盐WP表现出较高的抑制率。在质量浓度为100 g /L时，w=80%代森锰锌WP的抑菌率为100%，病菌生长完全受到限制；w=10%苯醚甲环唑WG次之，抑菌率为94.3%；250 g/L嘧菌酯SC在最高质量浓度中抑菌率表现最差，仅为52.7%。

2.3.2 供试药剂对温郁金根腐病菌丝的室内毒力测定从表3可知，430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鲜胺锰盐WP、w=50%多菌灵WP、w=10%苯醚甲环唑WG对温郁金根腐病菌的EC50较小，分别为0.002、0.024、2.225和2.646 g/L，表现较敏感，其中430 g/L戊唑醇SC对根腐病菌的毒力最强，w=80%代森锰锌WP、w=70%甲基硫菌灵WP和250 g/L嘧菌酯SC对温郁金根腐病菌的毒力相对较弱，其EC50分别为13.279、32.584和61.421 g/L。

图4 菌丝在不同的碳源下生长的结果Fig.4 Results of mycelia grow on different carbon sources

图5 菌丝在不同氮源下生长的结果Fig.5 Results of mycelia growth on different nitrogen sources

3 讨论

温郁金根腐病是温郁金生产中较为严重的病害之一，温郁金根腐病在原产地有报道但没有确定病原、生物学特性及防治药剂[8]。本文首次报道温郁金根腐病病原菌及生物学特性，温郁金根腐病菌鉴定为层出镰孢菌(F.proliferatum)。层出镰孢菌(F.proliferatum)可侵染水稻、小麦、玉米、大豆、芦笋、大蒜、洋葱等作物，引起枯萎病、腐烂病、软腐病等[9-10]。如王叶[11]报道的层出镰孢菌(F.proliferatum)可引起枣田间软腐病，徐鹏[12]报道层出镰孢菌(F.proliferatum)是玉米鞘腐病的主要致病菌，病菌主要通过分泌胞壁降解酶和毒素导致寄主发病。由于层出镰孢菌(F.proliferatum)常引起根腐烂病、枯萎病和软腐病等，可以初步确定分离的层出镰孢菌(F.proliferatum)是温郁金根腐病的病原之一。此外，李鹏昌[13]报道平脐蠕孢菌、黄色镰孢菌和层出镰孢菌均能引起小麦发病，但发病病情指数有差异。卢维宏等[14]报道拟轮枝镰孢菌F.verticillioides、层出镰孢菌F.proliferatum和亚黏团镰孢菌(F.subglutinans)均引起玉米穗腐病，只是发病指数有差别。由此可知，层出镰孢菌F.proliferatum是引起温郁金发病的病原之一，不一定是唯一病原菌。吕延超等[15]报道杧果畸形病的病原菌为层出镰孢菌(F.proliferatum)，其生物学特性研究结果表明，病原菌生长的最适温度为 24 ℃，最适 pH为 10；本研究结果表明，28 ℃下生长最好，pH 7～11时对其生长影响不大。最适温度及生长条件不一致的原因可能是培养基成分不一致。pH 7～11均能生长说明适宜温郁金根腐病病原菌生长的环境为偏碱性，如果土壤环境偏酸则不利发病。目前对根腐病病害防治鲜有报道，笔者确认430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鲜胺锰盐WP、w=50%多菌灵WP和w=10%苯醚甲环唑WG对病原菌的抑制效果较好，但田间防治试验是否稳定仍需进一步研究。

表2 不同杀菌剂的室内抑菌作用Table 2 Inhibition effects of different fungicides on the mycelium growth

表3 8种杀菌剂对温郁金根腐病菌菌丝生长的回归方程及EC50Table 3 Regression equation and EC50 of 8 fungicides against Fusarium proliferatum

4 结论

温郁金根腐病菌为层出镰孢菌(F.proliferatum)，最适培养基是查氏琼脂培养基，最适温度为28 ℃，pH和碳源对其生长影响不大，最适氮源为牛肉浸膏。另外，室内药剂筛选结果表明 430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鲜胺锰盐WP、w=50%多菌灵WP和w=10%苯醚甲环唑WG在室内均可有效抑制温郁金根腐病菌的生长，可进一步用于田间试验。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Biological Characteristics and Fungicides Screening for Pathogen of Root Rot onCurcumawenyujinY. H. Chen et C.Ling

CHEN Xuyu1,2, ZHONG Jinlin3, HE Chunping4, HUANG Xian5and GAN Bingchun1

(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine,Hainan Branch Institute of Medicinal Plant,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Wanning Hainan 571533,China; 2.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100193,China; 3.Lingnan Normal University,Zhanjiang Guangdong 5240483, China; 4.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops of Ministry of Agriculture,China Aacdenay of Tropical Agricultural Sciences,Environment and Plant Protection Institute, Hainan, Haikou 5711013,China; 5.Hainan Bikai Pharmaceutical Research Institute Co. Ltd., Haikou 570216,China)

In order to master and control the pathogen causing the root rot of theCurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling, biological characteristics and fungicides screening for the pathogen were studied. The biological characteristics and fungicides screening by PDA medium and the Face-to-face culturing on PDA plates, respectively. The results showed that the optimum medium and temperature for the pathogen mycelial growth were Czapek medium and 28 °C, respectively. Carbon sources and pH value did not affect the growth of mycelia of pathogen. In addition, the toxicological tests showed that 430 g/L tebuconazole SC andw=50% prochloraz-manganese chloride complex WP had strong activity against mycelia growth, itsEC50values were 0.002 g/L and 0.024 g/L. Follow by thew=50% Carbendazim WP andw=10% difenoconazole WG, theirEC50values were 2.225 g/L and 2.646 g/L, respectively. 430 g/L tebuconazole SC,w=50% prochloraz-manganese chloride complex WP,w=50% carbendazim WP andw=10% difenoconazole WG effectively inhibited the growth of pathogen and could be used in flied trials.

Curcumawenyujin；Root rot；Pathogen；Biological characterization；Fungicides screening

CHEN Xuyu, female,associate research fellow. Research area: plant protection and microbiology applied. E-mail: chenxuyu-11@163.com

GAN Bingchun,male, research fellow. Research area: pest control. E-mail:ganbingchun@126.com

2015-10-23

2016-03-11

国家科技重大专项 (2012ZX09304006)；海南省重大专项 (ZDZX2013008)。

陈旭玉，女，副研究员，研究方向为药用植物保护及微生物资源开发。Email: chenxuyu-11@163.com

甘炳春，男，研究员，研究方向为病虫害防治。Email: ganbingchun@126.com

日期：2016-12-20

S682

1004-1389(2017)01-0137-07

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.034.html

Received 2015-10-23 Returned 2016-03-11

Foundation item Special Important Program of the National Science and Technology (No.2012ZX09304006); Special Important Program of Hainan Province(No.ZDZX2013008).