陕西烟田主要病害种类调查与病毒分子检测

吴　宽，陈　伟，成巨龙，康振生

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌　712100；2.陕西省烟草研究所，西安　710061)

陕西烟田主要病害种类调查与病毒分子检测

吴宽1,2，陈伟1,2，成巨龙2，康振生1

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100；2.陕西省烟草研究所，西安710061)

摘要为明确陕西烟田病害种类，于2013-2015年对陕西烟田病害开展系统调查，鉴定出9种病害，分别是赤星病、白粉病、黑胫病、灰霉病、青枯病、角斑病、野火病、根结线虫病和病毒病，其中，赤星病、白粉病、灰霉病、黑胫病和病毒病发病普遍，危害严重；野火病、青枯病、角斑病和线虫病仅在个别烟田发生。烟草感染病毒的种类包括烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)，其中，CMV 、TMV、TEV和PVY检出率分别为23.6%、34.7%、21.3%和18.4%，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY检出率分别为27.4%、24.9%和20.9%，烟田病毒复合感染普遍，造成损失较大。

关键词烟草；赤星病；白粉病；黑胫病；花叶病毒病；多重PCR

近年来，随着烟草产业发展，烟田病害加重，每年因病害发生造成的产量损失约10%，严重时达30%以上，已成为制约烟草生产的主要问题。在中国烟田常年发生的病害有病毒病、赤星病、白粉病、黑胫病、青枯病、线虫病、角斑病和野火病等。烟草赤星病是由链格孢[Alternariaalternata(Fries) Keissler]感染引起[1]。20世纪80年代以来，赤星病在中国主要烟区均有发生，危害日趋严重，对烟叶产量和品质影响明显。据估测，每年赤星病发病面积约占中国植烟面积的30%～50%，直接导致烟叶外观品质下降，是目前中国烟草上发生范围最广、危害最重的一种叶部病害。仅1999年和2005年，由于赤星病流行使陕西烟叶品质严重受损，烟叶均价下降约1个等级。烟草白粉病、青枯病在中国华南、西南各省发生较为普遍，时有爆发流行[2]。烟草黑胫病首次在中国黄淮地区发现，由烟草黑胫病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)侵染引起，已连续多年严重危害烟草生产[3-4]。烟草灰霉病在广西、陕西等地均有报道，该病由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起[5-6]。根结线虫病由南方根结线虫(Meloidogyneincognita)侵染引起[7-8]，20 世纪80 年代前，仅在山东、河南、安徽、四川等省零星发生，80 年代中后期以来，发生面积逐年扩大，危害日益严重，目前在云南、河南、山东等13个主要产烟区均有发生，局部地区严重为害，损失较重。烟草角斑病在世界各地均有发生，在中国黑龙江烟区有报道，由丁香假单胞杆菌角斑专化型(Pseudomonassyringaepv.angulata)侵染引起[9]。烟草野火病在黑龙江、云南发生危害，20 世纪90 年代以来，因大面积种植单一品种等原因使该病害危害加重。烟草野火病是由烟草荧光假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起的细菌性病害，是烟叶产区普遍发生的病害之一[10-11]。近年来，广州[12]、陕西[13-15]、福建[16-17]、云南[18]、山东[19]、湖南[20]等多个省区均开展烟叶病毒病的鉴定研究。陈瑞泰等[16]对全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报道，魏宁生等[13]对陕西渭北烟区烟草蚀纹病毒原进行鉴定，成巨龙等[14]开展烟草病毒病的流行规律与预测预报研究。长期以来，国内对烟田真菌病害、细菌病害、线虫病害研究报道较少。因此，本研究于2013-2015年对陕西烟草病害种类进行系统调查鉴定，并进行病毒分子检测，以期为烟田病害综合防治提供一定依据。

1材料与方法

1.1病害调查与样品采集

于陕南、陕北、渭北烟草产区调查田间病害，采用5点调查法，记载植株发病症状、发病株率。样品采集后带回实验室分析，病毒病样品于超低温冰箱保存，备用。Taq盒为安徽优晶生物工程有限公司产品，pMD18-Tsimple vector购自宝生物工程(大连)有限公司，EscherichiacoliJM109 菌株由西北农林科技大学旱区逆境生物学国家重点实验室保存。

1.2病毒样品总RNA提取

称取0.1 g烟草病叶于研钵，加液氮研磨后迅速转至无RNase的无菌1.5 mL eppendorf管，加1 mL BIOzol Extraction Reagent 混匀，放置15 min，加入0.2 mL氯仿和0.3 mL苯酚溶液上下倒置混匀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取上清液转入新eppendof管，加入与上清液等体积的异丙醇，振荡混匀，-20 ℃放置30 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清液。用1 mLφ= 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，弃上清液，自然干燥。加入30 μL DEPC水溶解沉淀。-80℃保存，备用。以健康烟叶总RNA为阴性对照，提取方法同上。

1.3病毒扩增引物设计

根据已报道的烟草花叶病毒(TMV)云南分离物、黄瓜花叶病毒(CMV)中国株系、烟草蚀纹病毒(TEV)陕西分离物、马铃薯Y病毒(PVY)陕西分离物和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)河南分离物的外壳蛋白(CP)基因序列(GenBank登录号分别为AJ239099、EF417579、AY787757、EU719650和AM236820)，参照文献[11]设计引物，合成TMV cpF/TMV cpR、CMV cpF/CMV cpR、TEV cpF/TEV cpR、PVY cpF/PVY cpR和TVBMV cpF/TVBMV cpR 5种病毒的特异引物[11]。由于多重RT-PCR要求在相同退火温度下同时扩增多个目的片断，因此选择Tm值较一致的各对引物，保证在同一退火温度下可同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV。5种病毒的特异引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成，其中，TMV cpF：5′-TAGACCCGCT- AGTCACAG-3′，TMV cpR：5′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′；CMV cpF：5′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′，CMV cpR：5′-GTGGGA-ATGCGTTGGT-3′；TEV cpF：5′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′，TEV cpR：5′-GTGCCGTTC- AGTGTCTT-3′；PVY cpF：5′-CCGAG- AATCAAGGCTATC-3′，PVY cpR： 5′-CGCTAAACCTACATCCC-3′；TVBMV cpF：5′-GAGGTCG- TGAACTTACAGC-3′，TVBMV cpR：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′。

1.4多重RT-PCR检测方法

多重RT-PCR反应体系：取田间样品分别提取病毒总RNA，反转录合成cDNA，作为模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR反应。分别加入0.5 μmol/L引物各1 μL，退火温度48 ℃。再加入0.9倍PCR缓冲液，0.10 U/μLTaqDNA聚合酶，0.28 mmol/L dNTPs，2.4 mmol/L Mg2+，进行常规RT-PCR、电泳检测，记录结果。

1.5PCR产物的克隆与测序

采用烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)设计扩增产物大小分别为237、273、347、456、547 bp 的5条特异性条带。多重RT-PCR扩增DNA靶片段采用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，将纯化的PCR产物与pMD18-T simple vector 4 ℃连接过夜，采用CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态细胞，连接产物转化至大肠杆菌JM109，用Amp+和半乳糖苷酶的底物X-gal进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落PCR和限制性酶酶切分析进一步筛选后，将提取质粒送金思特科技(南京)有限公司测序。

2结果与分析

2.1烟田病害种类调查

于2013-2015年对陕西烟田病害进行调查，共鉴定出9种烟草病害，分别为赤星病、白粉病、黑胫病、灰霉病、青枯病、角斑病、野火病、根结线虫病和病毒病。调查发现，5月中旬，渭北、陕南烟区个别烟株下部叶片出现角斑病病斑，多出现在地头，零星发病；随后，随气温逐步升高，少数烟苗叶片开始出现花叶、疱斑病毒病症状，5月下旬，发病株率约为5.12%～8.47%，个别植株矮化，发病率迅速上升，呈发病高峰，至6月上旬发病株率达到15.41%～25.18%，同时，发病烟叶叶脉坏死，烟草蚀纹病和烟草脉带花叶病伴随发生。陕西7-8月为高温高湿季节，调查发现，除烟草病毒病快速传播扩散外，烟草白粉病在陕南、渭北烟区均有发生，洛南、陇县烟区发生较重，特别是进入7月份高温期后，遇到长时间降雨，或者烟田植株密度大、长势过旺、透风透光性差时发生较重，很容易暴发流行。白粉病主要为害叶片，严重时也感染幼茎。发病初期叶片表面出现白色绒状霉斑，以后逐步扩展至整个叶片，后期在叶片的正反面均可见白色粉状物。该病通常先由下部叶发生，自下而上逐渐蔓延，最终扩展至顶叶和茎秆，叶片逐渐失绿变黄，组织变薄，叶片坏死干枯，丧失经济价值。陕西省种植‘秦烟96’‘K326’的烟田均有发病，发病株率为3.71%～10.65%，严重时烟叶发病株率高达25.72%。同时，烟叶成熟期赤星病发病增多，田间表现潜育期短、流行速度快等特点。在降雨量较多的8月，烟田赤星病发病株率为5.29%～8.75%，严重田块发病株率高达32.94%～51.63%。赤星病和白粉病是陕西烟草生产中的主要真菌病害。

在陕南旬阳、南郑等烟区调查发现，烟草黑胫病菌时有发生，主要在老烟区局部发生，发病初期在茎基部产生黑斑，病斑向上下扩展，延及茎、叶及根部，容易引起倒伏；天气干燥时，病株干枯呈黑褐色，高温多雨时，病株腐烂，表面产生白色绵毛状霉，导致烟株烂死；该病主要为害成株的茎基部和根部，受害后茎秆髓部变黑，严重时茎秆干缩纵裂，水分营养疏导受阻，叶片萎蔫直至变黄，苗期发病较少。在汉中烟区调查发现，烟草青枯病零星发生，发病初期顶部叶片萎蔫，随后萎蔫叶片增多，植株生长不良，青干枯死。镇安、旬阳、白河、西乡和洋县烟田中发生南方根结线虫病害。灰霉病在全省烟区均有发生，且近年来有流行发生的趋势。同时，在这些烟区，烟草野火病零星发生，发生面积较小。陕西烟田病害发生情况见表1，烟草病害症状见图1。

表1　陕西烟田病害的发生情况

2.2烟田病毒种类的检测结果

采用多重RT-PCR从田间样品中扩增获得TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV 5种病毒条带，测序结果表明，其大小依次是237、273、347、456和547 bp(图 2)，均为CP基因的部分序列，且保守区同源率均达到100%。TMV、CMV、TEV和PVY检出率分别为23.6%、34.7%、21.3%、18.4%，其中，CMV和PVY是当前生产上发病率较高、造成损失较大的病害，尤其在老烟区发生较重；CMV、TEV和TVBMV均是蚜传病毒，受蚜虫迁飞时间影响明显，蚜虫迁飞时间早，3种病毒病发病重，TVBMV发生量较少。另外，检测结果还显示，烟田病毒混合发生普遍，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY发生率分别为27.4%、24.9%、20.9%，造成的损失均较大。

A.赤星病Brown spot；B.白粉病Powdery mildew；C.黑胫病Black shank；D.灰霉病Gray mold；E.青枯病Bacterial granville；F.角斑病Angle spot；G.野火病Wildfire；H.根结线虫病Nematode root-knot；I.烟草花叶病TMV；J.烟草黄瓜花叶病CMV；K.烟草蚀纹病TEV；L.烟草叶脉坏死病PVY；M.烟草脉带花叶病TVBMV

图1田间烟草病害症状

Fig.1Symptoms of field tobacco diseases

M.Marker；1.健康烟草Healthy tabacco；2.TMV；3.TMV+CMV；4.TMV+CMV+TEV； 5.TMV+CMV+TEV +PVY；6.TMV+CMV+TEV+PVY+TVBMV

图2烟草病毒的多重PCR检测

Fig.2Multiple PCR detection of tobacco viruses

3结论与讨论

陕西烟区病害发生普遍，于2013-2015年对陕西烟田病害进行调查采样，共鉴定出9种烟草病害，分别是赤星病、白粉病、灰霉病、黑胫病、青枯病、角斑病、野火病、线虫病和病毒病，其中，赤星病、白粉病、灰霉病、黑胫病、青枯病、角斑病和病毒病发病普遍，危害严重，野火病和线虫病仅在个别烟田发生。感染烟草的病毒种类包括TMV、CMV、PVY、TEV和TVBMV，其中，CMV 、TMV、TEV和PVY发生率分别为23.6%、34.7%、21.3%和18.4%，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY发生率分别为27.4%、24.9%和20.9%。说明：陕西烟田病毒混合发生普遍，造成的损失较大[13-15]。

陕西烟田病害种类较多，其中，烟草赤星病、灰霉病、病毒病寄主范围广，缺乏抗源，易暴发流行，严重影响烟叶的产量和品质，经济损失重大。赤星病容易暴发流行，随空气相对湿度的增加发病速度加快，具有间歇性和爆发性的特点，目前烟草赤星病已成为继病毒病之后的第二类大病害。因此，防治烟草赤星病已成为当前烟叶生产的重要工作。

白粉病发生范围广，严重时病斑布满叶片，使烟叶丧失经济价值。白粉病防治建议主要有：①选用抗病品种，如‘K326’‘云烟87’‘广黄10号’‘广黄46 号’‘广黄55号’‘白肋21’‘白肋52’等；②加强田间栽培管理，适时早栽，控制密度，及时采收，通风透光，增施钾肥、控制氮肥、平衡施肥，做好田间排水；③采用化学药剂防治，发病初期，选用粉锈宁(三唑酮)可湿性粉剂或甲基托布津可湿性粉剂[2]。烟草野火病在所有种烟省(区) 均有发生。目前，提高植物抗病性、种植抗病品种是控制该病害较有效的手段[10-11]。以前，烟草青枯病和烟草灰霉病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，中国仅在长江流域及其以南烟区普遍发生，而此次调查结果显示，灰霉病在陕西烟区有流行趋势。因此，在生产中应高度重视，提早预防，控制病害蔓延。

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Received 2015-10-01Returned2015-01-07

First authorWU Kuan, male，doctoral student.Research area:plant pathology.E-mail:wukuan1988@ nwsuaf.edu.cn

KANG Zhensheng, male, professor.Research area:plant immunology.E-mail:Kangzs@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Investigation of Main Tobacco Diseases and Viruse Molecular Detection in Shaanxi

WU Kuan1,2, CHEN Wei1,2, CHENG Julong2and KANG Zhensheng1

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100, China; 2.Shaanxi Tobacco Research Institute, Xi’an710061, China)

AbstractTo determine the pathogens of tobacco in Shaanxi province.Based on survey of tobacco fields from 2013-2015 in Shaanxi, nine kinds of diseases were identified respectively, such as brown spot, powdery mildew, black shank, gray mold, bacterial granville wilt, angle spot, wildfire, nematode root-knot and viral mosaic, of which brown spot, powdery mildew, gray mold, black shank, bacterial granville wilt, angular leaf spot and viral mosaic disease occured often in most years, and also leaded to serious destructions, reversely, wildfire and nematoda root-knot only happened in individual fields.Virus types of tobacco were made of tobacco mosaic virus (TMV), cucumber mosaic virus (CMV), potato virus Y (PVY), tobacco etch virus (TEV) and tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV), among them the detection rate of CMV, TMV, TEV and PVY were 23.6%, 34.7%, 21.3%, 18.4% respetively, for TMV+CMV, CMV+TEV, CMV+PVY was 27.4%, 24.9%, 20.9% respectively, mixing of virus occured widely, it decreased large losses in Shaanxi.So this study provides important guidance for tobacco disease control in the production.

Key wordsTobacco; Brown spot; Powdery mildew; Black shank; Viral mosaic; Multiple PCR

收稿日期：2015-10-01修回日期：2016-01-07

基金项目：中国烟草总公司科技重点项目(110200902046)；高等学校学科创新引智计划(B07049)。

通信作者：成巨龙，男，研究员，主要从事烟草病虫害研究。E-mail：julongc@126.com

中图分类号S435.72

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)06-0933-06

Foundation itemNational Tobacco Corporation (No.110200902046); the 111 Project of the Education Ministry of China (No.B07049). CHENG Julong, male, research fellow.Research area:tobacco protection.E-mail: julongc@126.com

网络出版日期：2016-06-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0919.040.html

第一作者：吴宽，男，博士研究生，研究方向为植物病理学。E-mail：wukuan1988@nwsuaf.edu.cn

康振生，男，教授，主要从事植物免疫学研究。E-mail：Kangzs@nwsuaf.edu.cn