杠柳新苷P和E对粘虫和小地老虎中肠3种解毒酶的影响

汪英英，胡兆农

(1.西北农林科技大学 植物保护学院 农药研究所，陕西杨凌　712100；2.陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西杨凌　712100)

杠柳新苷P和E对粘虫和小地老虎中肠3种解毒酶的影响

汪英英1,2，胡兆农1,2

(1.西北农林科技大学 植物保护学院 农药研究所，陕西杨凌712100；2.陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西杨凌712100)

摘要为进一步探讨杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制。比较研究高活性杠柳新苷P(Periploca sepium P，PSP)和无杀虫活性的杠柳新苷E(Periploca sepium E，PSE)对6龄粘虫幼虫(Mythimna separata)与小地老虎幼虫(Agrotis ypsilon)中肠3种代谢酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞色素P450-O-脱甲基酶]活性的影响。结果表明：药后8 h，PSP和PSE使粘虫幼虫GST活性增加，但PSP上升趋势比PSE更高。而2种化合物对试虫CarE活性均无明显影响。药后12 h，PSP和PSE使粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力显著下降，而小地老虎中该酶活性无明显变化。因此，可推测GST可能参与昆虫对杠柳毒素的解毒作用，而细胞色素P450-O-脱甲基酶活性被杠柳毒素抑制可能是造成粘虫中毒的机制之一。关键词杠柳新苷；粘虫；小地老虎；中肠；解毒酶

杠柳作为中国民间流传的一种土农药，其根皮提取物已被研究证实可作为控制一些鳞翅目害虫的杀虫剂，包括小菜蛾、菜粉蝶、粘虫等[1-3]。近期，西北农林科技大学植物保护学院农药研究所报道杠柳根皮中一些具有杀虫活性的孕糖苷骨架化合物，如杠柳新苷P(PSP)、杠柳新苷T、杠柳新苷NW等[4-7]。通过对这一系列化合物的生物决定，结果表明，PSP对3龄粘虫幼虫48 h的半数致死浓度(LC50)为110 mg/L，但对小地老虎无活性。杠柳新苷E(PSE)是除1个取代基不同外与PSP具相同分子结构的化合物(图1)[8]，对粘虫和小地老虎均无作用。而昆虫中肠作为分泌消化酶和其他酶类的主要部位，起着消化食物和吸收养分的重要作用，也是病原微生物、农药和各种毒素的作用靶标。同时昆虫中肠也是其体内主要的解毒部位，其中酯酶、细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)作为昆虫参与各种内源和外源化合物代谢的重要解毒酶，与植物外源化合物的降解和清除有关，尤其是昆虫体内的农药代谢，这些解毒酶发挥着极其重要的作用[9-11]。

外源性化学物质引起昆虫解毒酶活性变化可能会造成昆虫代谢紊乱，并影响其正常的生理生化过程[12]。目前，关于杠柳新苷类化合物对昆虫代谢酶系的影响报道较少，为进一步探讨杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制，本试验通过对比研究具有杀虫活性的化合物PSP和不具有杀虫活性的化合物PSE对粘虫和小地老虎幼虫中肠羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和细胞色素P450-O-脱甲基酶3种解毒酶活性的影响，以期初步明确杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制，为进一步研究其作用机制奠定基础。

杠柳新苷P Periplocoside P: R= H

1材料与方法

1.1供试昆虫

粘虫(Mythimnaseparate)和小地老虎(Agrotisypsilon) 6龄幼虫，由西北农林科技大学植物保护学院农药研究所提供。常规方法饲养，养虫室内温度为22～25 ℃、相对湿度为70%～80%，分别以小麦、甘蓝叶饲喂粘虫和小地老虎幼虫。试验时挑取整齐一致的6龄试虫。

1.2主要仪器及试剂

TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，DY89-Ⅰ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，MK3型酶标仪(美国热电上海仪器有限公司)，756MC型紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，420A型电热恒温水箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)，杠柳新苷P和E(纯度>95%)，由西北农林科技大学植物保护学院农药研究所自行制备提供。

毒扁豆碱、1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、谷胱甘肽(GSH)、NADPH、对硝基茴香醚(p-NA)均购自SIGMA公司。

EDTA、苯甲基硫酰氟(PMSF)、丙基硫氧嘧啶(PTU)、α-醋酸萘酯、α-萘酚、十二烷基磺酸钠(SDS)、坚牢蓝B、蛋白质定量试剂盒均为国产生化试剂。

1.3试虫处理

采用载毒叶片饲喂法，挑选生长发育一致的6龄粘虫和小地老虎于24孔板中，每孔放置1头，饥饿24 h，分处理药剂组和溶剂对照组。处理组分别点涂1 μL含2 g/L PSP或2 g/L PSE丙酮溶液于小麦和甘蓝叶片(约0.5 cm × 0.5 cm)上，小麦叶片饲喂粘虫，甘蓝叶片饲喂小地老虎，待丙酮挥发后，将小麦叶片放入24孔板中，每头试虫1张叶片。对照组试虫，饲喂点涂1 μL丙酮的叶片。分别取取食后2、4、8、12、24和48 h的药剂处理试虫及对照试虫各10头，用于酶液制备。每处理重复3 次。

1.4酶液制备

各供试试虫在冰袋上迅速解剖，用预冷的0.15 mol/L NaCl溶液冲去体液，截取中肠，去除胃食膜供试。GST活性测定酶液制备：将供试的中肠组织于预冷的玻璃匀浆器中，加入少量预冷的0.1 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液(含有φ=15%甘油，2 mmol/L EDTA)，冰上匀浆，10 000×g，4 ℃冷冻离心20 min。CarE活性测定酶液制备：将供试的中肠组织在0.04 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冰上匀浆，12 000×g，4 ℃冷冻离心15 min。细胞色素P450-O-脱甲基酶活性测定酶液制备：将供试的中肠于0.1 mol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液(φ=10% 甘油，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L PTU，1 mmol/L EDTA)冰上匀浆，10 000 ×g，4 ℃冷冻离心20 min。所有上清液置于离心管中，立即用作相关检测。

1.5酶活性测定

参照Booth等[13]的方法测定GST活性。CDNB为底物，反应体系包括：酶液、CDNB和GSH，室温下测定340 nm时反应5 min 内变化。消光系数为9.5 L/(mmol·cm)。

参照Asperen[14]的方法测定CarE活性。该反应体系包括：酶液、α-醋酸萘酯(含0.3 mmol/L毒扁豆碱)和显色液，显色30 min后，于595 nm比色。根据制作的标准曲线和酶液的蛋白质质量分数，以每分钟水解生成的α-萘酚的量nmol/(mg·min)作为CarE酶比活力。

参照Hansen等[15]的方法测定细胞色素P450-O-脱甲基酶活性。反应体系包括：酶液、对硝基苯甲醚、NADPH及磷酸钠缓冲液。振摇30 min后，加盐酸终止反应，然后用CHCl3萃取产物硝基苯酚，3 000 ×g离心15 min。用NaOH反萃取氯仿馏分，405 nm下测定NaOH馏分的吸光度。

1.6蛋白质质量分数的测定

蛋白质质量分数的测定参照Bradford[16]的方法，使用牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.7数据统计与分析

采用SPSS 17.0(SPSS Inc., Chicago, IL)对试验数据进行分析。独立样本t-test法进行显著性差异分析，P<0.05水平为差异显著。

2结果与分析

2.1杠柳新苷P和E对粘虫幼虫中肠和小地老虎幼虫中肠GST活性的影响

图2为杠柳新苷P(PSP)和E(PSE)对6龄粘虫幼虫和6龄小地老虎幼虫中肠GST酶比活性的影响。粘虫取食杠柳新苷P和E处理叶片8 h 后，中肠GST酶比活力开始逐渐增加。在PSP处理粘虫幼虫12、24和48 h后，中肠GST酶比活力处理组与对照组差异显著，处理组比对照组增加17.95%，29.19%和36.90%。PSE处理粘虫幼虫24和48 h后，中肠GST酶比活力处理组与对照组差异显著，处理组比对照组增加14.24%和20.61%(图2-A)。由图2-B可知，PSP和PSE对小地老虎中肠GST酶比活力均无显著影响。PSP处理小地老虎幼虫中肠GST酶比活力仅在2 h增加7.96%，随后各时间点处理组与对照组酶比活力无显著差异。由此可知PSP对粘虫中肠GST酶比活力的影响比PSE影响较大，进一步说明粘虫幼虫对PSP表现的更为敏感。

2.2杠柳新苷P和E对粘虫幼虫和小地老虎幼虫中肠CarE活性的影响

由图3可知，杠柳新苷P和E处理6龄粘虫幼虫和小地老虎幼虫后，与对照相比，仅处理48 h后，粘虫幼虫中肠CarE酶比活力相应增加12.16% 和9.55%，与对照组存在显著差异 (图3-A)。由图3-B可知，2种化合物处理小地老虎幼虫后，中肠CarE酶比活力与对照组无显著差异。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同

Different lowercase letters show significant difference(P<0.05),different uppercase letters show extremely significant difference(P<0.01).The same as below

图2杠柳新苷P和E处理6龄粘虫幼虫(A)和小地老虎幼虫(B)在不同时间点其中肠GST酶比活力

Fig.2GST specific activity of 6th instar larvae ofM.separata(A) andA.ypsilon(B) after treatment with PSP and PSE for different times

图3　杠柳新苷P和E处理6龄粘虫幼虫(A)和小地老虎幼虫(B)在不同时间点其中肠CarE酶比活力

2.3杠柳新苷P和E对粘虫幼虫和小地老虎幼虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶活性的影响

由图4可知，杠柳新苷P处理粘虫幼虫8 h后，中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力表现出抑制作用。在12、24和48 h的抑制率相应为28.41%，40.51%和34.57%。杠柳新苷E在2～8 h 对粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力的影响无显著差异，但在12、24和48 h处理组与对照组之间的抑制率存在显著差异，相应为13.90%，31.04%和24.45%。活性化合物PSP相比PSE表现出对粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶更强的抑制作用(图4-A)。然而，2种化合物对小地老虎中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶均无显著影响(图4-B)。

图4　杠柳新苷P和E处理6龄粘虫(A)和小地老虎(B)幼虫不同时间点其

3讨 论

昆虫中肠的解毒系统主要包含色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶、酯酶等，当有害物质进入昆虫消化系统后，解毒酶会将其进行降解或清除，这必定会引起解毒酶活性的增加或降低[17]。粘虫摄取杠柳新苷类化合物后，GST酶比活力在8 h后，尤其是24 h和48 h后显著增加，但是小地老虎中肠GST酶比活力无明显变化。GSTs是内源和异生物质解毒中心部位，包括对药物、除草剂、杀虫剂等[18]。杠柳新苷类化合物作为异生物质进入粘虫体内，引起GST酶比活力增加，可能引起昆虫的应激反应，通过增加酶活性来进一步降解有害物质。在麦长管蚜(Sitobionavenae)中也发现，吲哚生物碱能引起GSTs活性增加，推测GSTs参与对植物次生代谢物的解毒[19]。另外，GSTs活性增加也可作为昆虫解毒代谢的敏感指示[20]。杠柳新苷类化合物处理粘虫8 h后，细胞色素P450-O-脱甲基酶的酶比活力受到明显抑制，这可能与化合物的杀虫活性有关。细胞色素P450s参与解毒或有害物的活化，是药物或杀虫剂代谢、抗性、选择性和适应性的决定因素[21-23]，酶比活力受到抑制，导致昆虫代谢受阻，抑制昆虫的正常生理生化反应，因此加速对昆虫的毒性。小地老虎中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶对化合物不敏感，没有引起酶比活力的变化。杠柳新苷类化合物对粘虫和小地老虎CarE活性均无明显作用，CarE能水解大部分的羧酸酯类，可将化学合成杀虫剂降解为低毒化合物[24-26],说明化合物对羧酸酯酶的水解作用无影响。这可能与杠柳新苷化合物的结构有关，即不含有酯基结构。Khan等[27]研究表明斑蝥素对CarE活性也无明显作用。

通过对昆虫3种解毒酶活性的测定，推测中肠细胞色素P450活性的抑制可能与杠柳新苷P的中毒机制有关，而谷胱甘肽-S-转移酶参与对杠柳化合物的解毒机制。杠柳新苷P和E化学结构相似，只有1个取代基不同，这可能影响到化合物与靶标位点结合的紧密性。但杠柳新苷P如何影响昆虫的生理生化过程还不清楚。

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Received 2015-04-25Returned2015-05-11

First authorWANG Yingying, female, master student.Research area: pesticide toxicology.E-mail: wang553135575@163.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

Effects of Periplocoside P and E fromPeriplocasepiumon Activities of Three Detoxification Enzymes in Midgut ofMythimnaseparatandAgrotisypsilon(Lepidoptera：Noctuidae)

WANG Yingying1,2and HU Zhaonong1,2

(1.Institute of Pesticide Science,College of Plant Protection,Northwest A & F University, Yangling Shaanxi712100, China;2.Key Laboratory of Botanical Pesticide R & D of Shaanxi Province, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractPeriplocosides on detoxification enzymes in midgut of larvar has not been reported.In order to reveal the insecticidal activity and the effect of periplocosides on activities of detoxification enzymes in midgut of larvar.We investigated the effects of strong insecticidal periplocoside P (PSP) and periplocoside E (PSE) which had no insecticidal activity on the activities of three metabolism enzymes in midgut of 6th instar larvae of Mythimna separata and Agrotis ypsilon, including carboxylesterase (CarE), glutathione S-transferase (GST) and O-demethylase of cytochrome P450.GST activity could be increased by PSP and PSE when M.separata larvae were administrated orally with both compounds after 8 h, but PSP showed higher rise trend of GST than PSE.Both compounds showed no obvious effect on CarE activity of the tested insects.The activity of O-demethylase of cytochrome P450 on M.separata was significantly declined by PSP and PSE after 12 h, whereas had no obvious changes on A.ypsilon.The cytochrome P450 in the midgut may be relevant to the intoxication mechanism of PSP against M.separata, whereas GST may be involved in detoxification of periplocosides in insects.

Key wordsPeriploca sepium；Mythimna separata； Agrotis ypsilon；Midgut; Detoxicifition enzymes

收稿日期：2015-04-25修回日期：2015-05-11

基金项目：国家自然科学基金(31171868)；中央高校基本科研业务费专项(QN2011058)。

通信作者：胡兆农，男，博士，教授，博士生导师，主要从事农药毒理学研究。 E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

中图分类号S481+.1

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)06-0939-06

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China(No.31171868); Special Funds of Scientific Research Expenses for Universities under the Chinese Central Government(No.QN2011058). HU Zhaonong, male, Ph.D,professor, doctoral supervisor.Research area: pesticide toxicology.E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

网络出版日期：2016-06-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0920.042.html

第一作者：汪英英，女，硕士研究生，从事农药毒理学研究。E-mail: wang553135575@163.com