气质联用法和MALDI-TOF-MS测定羟丙基-β-环糊精平均取代度

张　璟，高保卫，蔡崇林，唐光辉，王智辉，吴兴元

(1.西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心/ 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌　712100；2.西北农林科技大学 林学院，陕西杨凌　712100)

气质联用法和MALDI-TOF-MS测定羟丙基-β-环糊精平均取代度

张璟1，高保卫1，蔡崇林1，唐光辉2，王智辉1，吴兴元1

(1.西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心/ 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学 林学院，陕西杨凌712100)

摘要为建立气质联用(GC-MS)和基质辅助激光电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)平均取代度的方法。对HP-β-CD先进行甲基化反应，后将其酸水解为单环葡萄糖单元，通过硼氢化钠还原成链状葡萄糖单元，经羟基乙酰化后，进行气质联用分析，计算平均取代度(DS)，并与MALDI-TOF-MS测定的结果进行比较。结果表明：利用GC-MS分析测得的DS为7.0，略高于使用MALDI-TOF-MS测得结果(DS=6.6)。GC-MS分析方法灵敏度较高，但是前处理步骤较为繁杂，MALDI-TOF-MS法能够快速检测样品，2种方法均可提供相关分析方法依据。

关键词羟丙基-β-环糊精；平均取代度；气质联用；MALDI-TOF-MS

羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HP-β-CD)是β-环糊精(β-CD) 与1, 2-环氧丙烷缩合而成的亲水性衍生物(图1)。该分子不具有还原性，在碱性介质中很稳定，能被强酸分解，与β-CD一样具有分子包合作用，对人体无毒。与β-CD不同的是，HP-β-CD在常温下水溶性高，在生物体内可促使包含物质迅速释放，表面活性、溶血活性低，使用更安全，是目前研究及应用最为广泛的β-CD衍生物。β-CD 的R2、R3和R6上的羟基被羟丙基随机取代,生成2-HP-β-CD、2, 3-DiHP-β-CD、2, 6-DiHP-β-CD 及2, 3, 6-TriHP-β-CD 等同系物。取代基数目对HP-β-CD物系的物性有重要影响，如溶血性、吸湿性和增溶能力均随取代度的增大而降低[1-6]。

关于HP-β-CD平均取代度的测定方法，目前尚无可靠和统一的规范。Schneide等[7]采用核磁共振氢谱和碳谱对 α-环糊精、β-环糊精及γ -环糊精进行分析研究；宋元德等[8]建立测定无对照品或者指示剂的HP-β-CD平均取代度的核磁共振氢谱方法；Pitha等[9]和Pitha[10]对HP-β-CD利用不同方法测定平均取代度(DS)，用核磁法测得DS=7，而质谱法测得DS=8.02；郝爱友等[11]报道化学滴定方法测定HP-β-CD取代度，无需大型仪器，在一般实验室即可实现平均取代度的测定；张毅民等[12]用紫外光谱法测定HP-β-CD平均取代度；张敏等[13]利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测β-CD与环氧丙烷的反应，合成出低取代(取代度< 8)的HP-β-CD。

目前，国内尚无气质联用法测定 HP-β-CD 平均取代度的相关报道，本研究采用气质联用(GC-MS)和MALDI-TOF-MS分析法测定HP-β-CD的平均取代度，为相关研究提供一定的方法借鉴。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司)；二甲亚砜，氢氧化钠，碘甲烷，氯仿，三氟乙酸，氨水，硼氢化钠，乙酸，甲醇，吡啶，乙酸酐，氯仿，无水硫酸钠等均为化学纯；POLARIS QGC-MS气质联用仪(美国Thermo fisher公司)；AXIMA-CFR plus MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(日本岛津公司)。

图1　羟丙基-β-环糊精的结构

1.2HP-β-CD前处理方法

1.2.1HP-β-CD的甲基化参照文献[9]的方法。称取100 mg HP-β-CD放入圆底烧瓶中，加入20 mL干燥的二甲亚砜，0.5 g氢氧化钠粉末，5 mL碘甲烷，用橡皮塞封紧瓶口，在室温下搅拌反应过夜。然后加入25 mL水，摇匀，再用20 mL×5氯仿提取，合并有机相，用20 mL水洗涤2次，减压蒸馏除去溶剂，得淡黄色甲基化产物。

1.2.2甲基化HP-β-CD的水解与还原向HP-β-CD甲基化产物里加入15 mL(2 mol/L)的三氟乙酸，在120 ℃下搅拌回流1 h，然后在50 ℃下用旋转薄膜蒸发仪蒸干溶剂，再加入10 mL(2 mol/L)的氨水，摇匀以便中和残存的痕量三氟乙酸。然后加入0.5 g硼氢化钠和15 mL(2 mol/L)的氨水配成的溶液，在60 ℃下反应60 min，降至室温，加入10 mL乙酸，使混合物通过阳离子交换树脂以除去其中的NH4+和Na+，通过离子交换树脂的混合物在60 ℃下旋蒸至干，得到的残余物用适量干燥甲醇溶解，再在60 ℃下旋蒸至干，如此反复3次以除去残余的硼，得到的油状物为水解还原后的链状D-葡萄糖衍生物。

1.2.3乙酰化参照文献[14-15]的方法。将上述反应产物用20 mL吡啶溶解，在0 ℃下加入新蒸的10 mL乙酸酐，加完后用橡皮塞封口，室温搅拌反应过夜。反应完毕后在50 ℃下除去溶剂，残余物用60 mL氯仿溶解，用10 mL饱和食盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得淡黄色油状物，待测。

1.3GC-MS分析条件

非极性毛细管柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：始温160 ℃，以3 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min，载气为氦气；离子源温度：200 ℃；进样口温度：250 ℃；分流比：20∶1；溶剂延迟时间：3 min；EI源：离子化电势70 eV。

1.4MALDI-TOF MS分析条件

采用氮激光仪，激发波长337 nm，激光脉冲宽度为3 nm，信号为激光器单次扫描50次累计结果。以α-氰苯-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)为基体，将基体与样品按1 000∶1 摩尔比混合均匀，取1 μL滴于样品台上室温干燥，送入离子源中。

1.5平均取代度的计算

GC-MS通过分子离子峰的峰高和质量来计算HP-β-CD的DS，具体公式为：

(1)

式中，Hi和Mi分别为每个分子离子峰的峰高和质量，1 135为β-CD分子量。

MALDT-TOF-MS的DS计算具体公式为：

(2)

2结果与分析

2.1色谱条件的优化

由于待测物组分比较复杂，通过毛细管色谱柱将单取代、多取代及混合取代等不同取代的β-CD完全分离具有一定难度，对于这些复杂成分，适当地调整程序升温速度，可使分离结果得到改善，但同时会使保留时间延长，导致峰型变宽，灵敏度降低，分析时间过长会降低实际检验的工作效率。为达到理想分离结果，本研究通过调整程序升温速度、更换不同极性色谱柱(TR-1MS，TR-5MS，HP-5MS)、改变载气流速等方法，最终确定色谱分离条件为色谱柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初始温度160 ℃， 3 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。总离子流色谱图见图2。

2.2GC-MS分析

图3为HP-β-CD经水解、还原和乙酰化后的产物，其中的R2、R3和R6分别为和C2、C3、C6通过醚键相连的羟丙基(羟丙基上的羟基在样品处理的第1步被甲基化)或甲基(未被羟丙基取代的羟基在样品处理的第1步被甲基化)。

因此，对上述HP-β-CD经水解、还原和乙酰化后的产物进行GC-MS分析，参考Pitha等[9]和Pitha[10]分析方法并在其基础上进行一定的修改，对HP-β-CD分子上羟丙基的取代度以及羟丙基取代在β-CD的葡萄糖单元的C2、C3、C6上的分布情况进行分析。

经GC-MS分析表明(表1)，无取代的葡萄糖单元含量为24.4%，单取代的葡萄糖单元含量为53.4%，双取代的葡萄糖单元含量为20.0%，三取代的葡萄糖单元含量为2.2%，取代位置以2位为主，6位次之，3位最少，同时还有部分2,3-和2,6-双取代和少量的2,3,6-三取代，根据公式(1)计算得HP-β-CD的DS为7.00。

图2　总离子流色谱图

图3　乙酰化D-葡萄糖醚

2.3MALDI-TOF MS基质选择

为得到更准确的检测结果，减少基质对检测结果的影响，本研究分别用α-CHCA、芥子酸(SA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)这3种基质与HP-β-CD混溶进行MALDI-TOF MS检测，经过对比试验，发现α-CHCA检测的效果最好，DHB次之。试验结果表明：采用不同的基质对HP-β-CD的检出结构有明显影响，适当地换用不同基质进行分析，才能确定最佳分析条件。

2.4MALDI-TOF MS质谱分析

从图4可见，离子1 329.59，1 387.51，1 446.05，1 503.77，1 562.10，1 620.45，1 678.53，1 736.40分别为β-CD(1 135)+23+3×58(羟丙基)，β-CD+23+4×58，β-CD+23+5×58，β-CD+23+6×58，β-CD+23+7×58，β-CD+23+8×58，β-CD+23+9×58，β-CD+23+10×58的离子，即β-环糊精与三取代、四取代、五取代、六取代、七取代、八取代、九取代、十取代羟丙基分别和钠的加和离子，且基峰为含有7个羟丙基的β-环糊精与钠的加合离子，根据公式(2)计算其HP-β-CD的DS为6.6。

表1　气质联用法测定HP-β-CD各取代成分比例

图4　HP-β-CD的MALDI-TOF质谱图

3结 论

GC-MS分析方法测定HP-β-CD平均取代度，需要进行样品前处理。首先，通过酸水解将其分解为单环葡萄糖单元，然后通过硼氢化钠还原成链状葡萄糖单元，为防止在酸水解时未被羟丙基化的葡萄糖单元上的羟基和羟丙基上的羟基在酸水解过程发生脱羟基反应、以及在硼氢化钠还原时被还原，在水解之前先用过量的碘甲烷将HP-β-CD上所有的羟基都保护起来，然后进行水解和还原。还原成链状的单糖后，由于单糖分子上至少含有2个羟基，极性大，沸点高，无法用GC-MS准确分析，需要用过量乙酸酐将所有羟基乙酰化后才能进行分析。

利用GC-MS分析法测得的平均取代度略高于MALDI-TOF-MS方法所得结果，可能是由于GC-MS分析方法通过分子离子峰的峰高和质量计算HP-β-CD的平均取代度，而样品中若含有杂质会导致分子离子峰的峰高和质量偏大，使得HP-β-CD的平均取代度值偏大。

GC-MS分析方法灵敏度较高，但是前处理步骤较为繁杂，MALDI-TOF-MS方法不需对样品进行前处理，能够快速分析，直接检测样品。2种方法各有优势，均可为今后相关研究工作提供分析方法方面的参考依据。

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Received 2015-05-13Returned2015-07-07

First authorZHANG Jing , female, experimentalist, Ph.D student. Research area:synthesis and analysis of pesticide. E-mail: zhjing008@126.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

Determination of Average Degree of Substitution of Hydroxypropyl-β-cyclodextrin by Gas Chromatography Mass Spectrometry and MALDI-TOF-MS

ZHANG Jing1, GAO Baowei1, CAI Chonglin1,TANG Guanghui2,WANG Zhihui1and WU Xingyuan1

(1.Shaanxi Research Center of Biopesticide Technology and Engineering , Biorational Pesticide R&D Center Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China;2.College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractGC-MS and matrix-assisted laser desprption-ionization time of flight mass spectro (MALDI-TOF-MS) metry were established to measure degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin methylation reaction, then were decomposed into acid hydrolysis monocyclic glucose units by sodium borohydride reduction into chains of glucose units, after hydroxyl acetylation of GC-MS, we calculated the average degree of substitution. We compared it with those gained from the method of MALDI-TOF-MS.The average degree of substitution was 7.0 which was examined by GC-MS,slightly higher than MALDI-TOF-MS with measured results (DS=6.6).GC-MS analysis had high sensitivity, but the pre-treatment step was more complicated. MALDI-TOF-MS detected the sample rapidly, both methods were available to measure the degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin which can provide a basis for correlation analysis.

Key wordsHydroxypropyl-β-cyclodextrin; Degree of substitution; GC-MS; MALDI-TOF-MS

收稿日期：2015-05-13修回日期：2015-07-07

基金项目：西北农林科技大学大型仪器设备新功能开发项目(dysb130307)。

通信作者：高保卫，男，实验师，主要从事农药合成和分析的研究。E-mail:gaobaowei72@163.com

中图分类号S482.92；O657.6

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)06-0945-05

Foundation itemKey Scientific Instrument and Equipment Development Project of Northwest A&F University(No. dysb130307). GAO Baowei, male, experimentalist. Research area: synthesis and analysis of pesticide .E-mail: gaobaowei72@163.com

网络出版日期：2016-06-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0920.044.html

第一作者：张璟，女，实验师，在读博士，从事农药合成和分析的研究。E-mail:zhjing008@126.com