猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

吴旭锦，朱小甫

(咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，动物疫病分子生物学诊断实验室，陕西咸阳　712000)



猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

吴旭锦，朱小甫

(咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，动物疫病分子生物学诊断实验室，陕西咸阳712000)

摘要为给临床快速鉴别诊断猪瘟提供技术依据，根据GenBank公布的CSFV全基因序列，结合猪瘟序列测定结果，针对 NS5B基因区域设计2条通用外扩引物、2条通用内扩引物和1条疫苗毒株特异性内扩引物，建立一种可鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR诊断方法。结果显示，该方法可从HCLV株扩增出2条大小分别为261 bp和157 bp的片段，可从Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株扩增出1条261 bp的片段，其他几种常见猪病毒检测均呈阴性；灵敏度试验表明，检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7pg/L；116份临床样品中有37份样品检测呈阳性，阳性率为32%；分析部分阳性病料 E2基因序列也证实检测结果的准确性。说明：建立的RT-nPCR鉴别诊断方法灵敏度高、特异性好，能直观区分猪瘟疫苗毒株和流行毒株。

关键词猪瘟；反转录-复合套式聚合酶链式反应；鉴别诊断

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是一种高度接触性传染病，其病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，猪和野猪是其唯一宿主[1]。关于CSF的报道最早可追溯至19世纪早期，该病一直是严重危害养猪业的烈性传染病，中国农业部将其列为一类动物疫病。CSFV属黄病毒科，瘟病毒属，是一种单股正链RNA病毒，基因组全长约12.3 kb，仅含1个大的开放阅读框(ORF)，编码蛋白的顺序依次为NPRO、C、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[2]。

中国学者[3-4]于20世纪50年代研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，为控制猪瘟做出重要贡献。但由于多种原因，中国至今未能消灭猪瘟，猪瘟的流行出现新变化，免疫失败现象屡见不鲜，猪瘟症状非典型化、温和型猪瘟及母猪隐性带毒现象普遍。多年来，国内常采用以疫苗预防为主的猪瘟防控策略，使猪群疫苗免疫覆盖率高，疫苗毒株在猪群中广泛存在，并且近几年流行的蓝耳病临床症状和剖检变化与猪瘟相似，导致猪瘟临床诊断难度增大[3-4]。目前，多通过实验室手段诊断猪瘟，国内常用的猪瘟诊断方法有兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与鉴定试验、直接免疫荧光抗体试验及RT-PCR技术等[5-6]，但常规荧光抗体试验和RT-PCR技术不能区分疫苗毒株和猪瘟流行毒株。

国内学者尝试建立系列的猪瘟鉴别诊断方法，如赵耘等[7]建立RT-PCR和酶切的方法以区分猪瘟强毒与疫苗弱毒，但该技术无法确诊早期感染且操作较繁琐；赵建军等[8]建立鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量RT-PCR检测方法，但该方法成本较高，且目前仅应用于实验室检测；李艳等[9]建立鉴别猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR检测方法，通过特异条带大小可判断猪瘟毒性强弱；谢金文等[10]建立的鉴别方法的扩增极限为5×RID50细胞疫苗基因组拷贝，灵敏度较低，可能会造成漏诊。鉴于前人研究的不足，本研究拟选取高保守 NS5B基因区域，建立一种可鉴别疫苗毒株和流行毒株的方法，不进行测序、酶切就可以直观区分2种毒株，以期为临床快速鉴别诊断猪瘟提供依据。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1病 毒猪瘟病毒SXYL2006株(GenBank登录号GQ122383)、GX54、SD2002，均由咸阳职业技术学院动物疫病分子生物学诊断实验室采集。根据PK-15细胞传代分离测定全基因序列，并通过基因比对证实SXYL2006株、GX54为基因Ⅱ群流行毒株，SD2002为基因Ⅰ群流行毒株。猪瘟疫苗HCLV株、蓝耳毒株CH-1R、伪狂犬Bartha-K毒株疫苗，均由普莱柯生物工程股份有限公司生产；Shimen株、牛流行性腹泻病毒(BVDV)、圆环病毒2型(PCV-2)、细小病毒(PPV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)，均由咸阳业技术学院动物疫病分子生物学诊断实验室保存。

1.1.2病料和血清病料和血清由陕西省科学技术研究发展计划项目“鉴别猪瘟疫苗株和流行毒株诊断试剂盒的研制与推广”课题组采集或由猪场送检，共116份。组织病料研磨处理后，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，-70 ℃保存，备用。

1.1.3试剂TRIzol Reagent和DNAzol Reagent，均为Invitrogen公司产品；AMV反转录酶(10 U/ μL)、RNA酶抑制剂(40 U/ μL)、DEPC处理水、rTaq酶(5 U/ μL)、dNTP(各成分均为10 mmol/L)等，均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；DL2000 Marker，为宝生物工程(大连)有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2方 法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank公布的30多个CSFV、BVDV全基因组序列，结合陕西省科学技术研究发展计划项目“鉴别猪瘟疫苗株和流行毒株诊断试剂盒的研制与推广”课题组数年研究测定的CSFV全基因序列，经过综合分析比对，筛选出CSFV疫苗毒株和其他流行毒株以及BVDV的差异位点，并设计5条引物，引物序列：S1， 5′-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3′；S2，5′-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3′；S3，5′-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3′；S4，5′-CCTGGCATGTAACTA-3′；S5，5′-CTCTCGGTGAG-AAATTTG-3′。预期CSFV流行毒株扩增出1个261 bp的片段，疫苗毒株扩增出261 bp、157 bp 两个片段。为验证检测结果的准确性，参考文献[11]合成扩增 E2基因的2对引物P1/P2和P3/P4，引物序列：P1，5′-GTAACTGGGGCACAAGG-3′；P2，5′-TTATCACTATCAGCCACAGGACA-3′；P3，5′-TCGACAACCAATGAG-ATAGGG-3′；P4，5′-CACAGCCCAAATCCAA-AGTCATC-3′。预期扩增 E2基因主要抗原区片段272 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，均用DEPC处理水稀释至20 μmol/L。

1.2.2RNA的提取和第1链cDNA合成取HCLV株疫苗溶液250 μL，按照TRIzol Reagent试剂说明提取总RNA，倒置离心管自然干燥。在核酸干燥过程中，配制反转录反应液： DEPC处理水12.5 μL，下游引物S2 1.0 μL，dNTP 2.0 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，AMV 0.25 μL，RNA酶抑制剂 0.25 μL，总体积20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反转录反应液充分溶解，置42 ℃水浴反转录90 min，取出后通过微量紫外分光光度计测定cDNA质量浓度。

1.2.3CSFV反转录-复合套式PCR检测方法的建立取已知质量浓度的cDNA溶液为模板，摸索扩增条件。第1次扩增反应体系：cDNA 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，S1、S2各0.5 μL，改变rTaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，超纯水补足25.0 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；进入循环后94 ℃ 40 s变性，退火温度由52 ℃至58 ℃ 按1 ℃递增设定退火50 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取2.0 μL第1次扩增产物为模板，进行第2次扩增，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，S3、S4、S5各0.5 μL，改变rTaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，超纯水补足25.0 μL；反应条件：95 ℃预变性 5 min；进入循环后94 ℃ 30 s变性，退火温度由52 ℃至58 ℃按1 ℃递增设定退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。摸索出反应体系和反应条件的最佳组合。

1.2.4CSFV反转录-复合套式PCR检测方法灵敏性试验将cDNA溶液按10倍梯度稀释至109倍，分别以稀释后的cDNA溶液为模板进行PCR扩增。按照摸索出的最优体系与条件进行复合套式PCR反应，取5.0 μL第2次扩增产物，进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。

1.2.5CSFV反转录-复合套式PCR检测方法特异性试验提取HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV和PRRSV总RNA，按照建立的方法进行反转录-套式复合PCR；根据DNAzol Reagent试剂说明，提取PCV-2、PRV、PPV等DNA病毒的DNA作为模板，用建立的方法做套式复合PCR，PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，成像系统中观察照相。

1.2.6病料中CSFV的检测用上述方法对收集的116份组织病料和血清进行检测，验证方法的实用性。

1.2.7阳性病料中 E2基因扩增与测序分析选取部分检测阳性的病料，按照文献[11]的方法扩增 E2基因，PCR产物纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化至DH5ɑ感受态细胞，经Amp筛选，挑取单个菌落，37 ℃摇动培养至饱和，菌液PCR鉴定为阳性，提取质粒，BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。采用DNAstar软件分析比较获得序列的核苷酸和氨基酸同源性，并绘制系统发生树，验证诊断方法的准确性。

2结果与分析

2.1CSFV反转录-复合套式PCR检测方法的建立

通过改变反应体系中rTaqDNA聚合酶用量和Mg2+用量，改变反应条件中的退火温度，优化反应体系和反应条件，最终确定最优体系和条件为：第1次扩增cDNA 2.0 μL，超纯水16.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL， dNTP 1.0 μL，S1、S2各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，总体积25.0 μL；反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 50 s，72 ℃50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。第2次扩增反应体系和条件为：第1次扩增PCR产物 2.0 μL，超纯水15.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL， dNTP 1.0 μL，S3、S4、S5各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，总体积25.0 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

2.2CSFV反转录-复合套式PCR检测方法的灵敏性

测定反转录第1链cDNA质量浓度为3.4 pg/L，10倍梯度稀释后进行套式扩增。由图1可知，建立的方法扩增出的可见目的条带的最大稀释度为107，即检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7pg/L。说明：此方法灵敏度高，完全满足CSFV临床检测需要。

M. DL2000 DNA Marker；1～10. 依次为3.4×10-1～4.0×10-7pg/L cDNA PCR结果3.4×10-1-3.4×10-7pg/L of CSFV cDNA respectively

图1CSFV反转录-复合套式PCR检测灵敏度

Fig.1The result of sensitivity test of reverse

transcription-complex nested PCR for CSFV

2.3CSFV反转录-复合套式PCR检测方法的特异性

采用建立的方法对HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV、PRRSV、 PCV-2、PRV、PPV等进行复合套式PCR扩增，结果显示，HCLV株出现2条大小分别为261 bp、157 bp的条带，Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002出现1条261 bp条带，BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV均未出现条带(图2)。可见：建立的方法能准确扩增CSFV基因片段，并能直观区分疫苗株和流行毒株，即使是与HCLV同源性很高的经典强毒株Shimen，也能进行准确区分，且其他常见猪源病毒均未扩增出条带，说明建立的方法具有较高的特异性。

2.4病料中CSFV检测

采用建立的方法检测116份疑似CSFV的猪肺脏、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏等组织以及血清等样品。结果显示，37份样品呈阳性，阳性率为32%，部分病料检测结果见图3。

2.5阳性病料中 E2基因扩增与测序分析验证

从选取的部分阳性病料中获得11株 E2基因序列(图4)，连续命名为SX01～SX11，将序列提交至GenBank，获得的登录号为KM233874～KM233884。采用DNAstar软件比较分析获得序列与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性，参考毒株包括HCLV株、Shimen株以及欧盟猪瘟参考实验室公布的已知亚型的CSFV参考毒株(AJ781111，Subgroup 1.2；AJ781096，Subgroup 1.3；AY450284，Subgroup 2.1；L36167，Subgroup 2.2；L36170，Subgroup 2.3；AF521708，Subgroup 3.2；AF24169，Subgroup 3.3；AY526731，Subgroup 3.4)。对这些毒株进行基因分群和系统发生树分析(图5)，结果表明，11个阳性样品的 E2基因均属于Subgroup2.1，为近年猪瘟流行的优势毒株，证实建立的鉴别诊断方法是准确特异的。

M. DL2000 DNA Marker；1～10.分别为HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV毒株扩增结果The result of HCLV, Shimen, SXYL2006, GX54, SD2002, BVDV, PRRSV, PCV-2, PRV and PPV respectively

图2CSFV反转录-复合套式PCR检测方法的特异性

Fig.2 The result of specialization test of reverse

transcription-complex nested PCR for CSFV

3讨 论

迄今为止，猪瘟仍是严重危害中国养猪业的重大疫病之一，早期诊断在控制猪瘟疫情中发挥重要作用。现行国标GB/T16551-2008规定，猪瘟诊断技术有临床及病理学诊断、病原学诊断和血清学诊断3个层次[12]。临床及病理学诊断具有操作简单、不需要仪器、现场即可操作的优点，但该方法主观影响大，尤其在混合感染或继发感染等病情复杂时鉴定的准确性低。猪瘟单抗酶联免疫吸附试验可区分疫苗抗体和野毒抗体，特异性好，但灵敏度较低，且抗体产生较晚，不能进行早期诊断。病原学诊断方法中，兔体交互免疫试验和病毒分离鉴定试验操作繁琐、耗时长、检出率较低，不适合临床快速诊断。免疫酶染色试验和直接免疫荧光抗体试验检测抗原操作简便，但灵敏度较低，无法区分疫苗抗原和野毒抗原[13]。

M. DL2000 DNA Marker；P1. 疫苗阳性对照HCLV positive control；P2. Shimen毒株Shimen strain；N. 阴性对照Negative control；1～20. 部分病料检测The detection result of some tissues

图3部分疑似CSFV病料检测结果

Fig.3The result of detection from some dubitable effected CSFV tissues

M. DL2000 DNA Marker； 1～6. 部分CSFV阳性病料 E2基因扩增The result of clone E2 gene from CSFV positive tissues

图4部分CSFV阳性病料中 E2基因扩增结果

Fig.4The result of clone E2 gene

from CSFV positive tissues

随着分子生物学技术的发展，多种扩增CSFV特异性片段的RT-PCR方法被用于CSFV诊断。Wirz等[14]根据CSFV基因组的高保守区域序列建立RT-PCR检测方法，与组织培养和免疫荧光染色法比较，该方法能更快区分CSFV。Liu等[15]建立的RT-PCR方法灵敏性可检测到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[16]和Goldrick等[17]建立套式RT-PCR检测方法，其灵敏性比常规RT-PCR高1 000倍，具有检出率高、特异性强的特点。Risatti等[18]开发了一种可用于检测鼻腔棉拭子中猪瘟病毒的实时RT-PCR方法，其敏感性比病毒分离高，但特异性略低。周绪斌等[19]建立复合RT-PCR方法，对BVDV和CSFV的最小检出量达10-1TCID50。朱小甫等[11]针对 E2基因建立套式RT-PCR方法，对CSFV cDNA检测量的最低极限为1×10-7μg/L，有灵敏度高、特异性好的特点。张朝红等[20]通过比较病毒分离鉴定、荧光抗体法、RT-PCR和夹心ELISA，发现RT-PCR检测法具有快速、敏感等特点，尤其是在样品保存不理想时也能进行快速、高效检测，利用套式PCR可以提高检测的特异性。国标GB/T16551-2008也规定检测CSFV的套式RT-PCR方法。但以上方法均不能区分疫苗毒株和流行毒株，扩增CSFV特异性片段后不能直接判断是疫苗还是野毒。

图5　基于 E2基因构建系统发生树

目前，公开报道的鉴别猪瘟类型的诊断方法较多，如通过RT-PCR和酶切的方法区分猪瘟强毒与疫苗弱毒[7]，以及通过复合荧光定量RT-PCR检测方法鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株[8]等。RT-PCR配合酶切的方法操作比较费时繁琐，荧光定量法成本高，设备要求高，普及有一定难度。李艳等[9]建立鉴别猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR检测方法，发现强毒时出现1条343 bp的特异条带，弱毒时出现1条447 bp的特异条带，检测极限为0.04 pg，但这2个条带大小相近，不易区分，直观判别性不强。谢金文等[10]建立的鉴别方法的扩增极限为5×RID50细胞疫苗基因组拷贝，灵敏度较低，可能会造成漏诊。

鉴于前人研究的不足，本研究选取CSFV高保守基因 NS5B为靶基因，设计反转录-复合套式PCR鉴别诊断方法。其中，S1/S2为外扩引物，S3/S4为内扩通用引物，所有猪瘟病毒均可扩增出261 bp条带，S5为疫苗株内扩特异性引物，S3/S5引物组合仅猪瘟兔化弱毒株可扩增出157 bp条带。特异性试验证实，建立的方法检测HCLV株出现2条大小分别为261 bp、157 bp的条带，Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株仅出现1条261 bp的条带，猪群常见的几种其他病毒的检测结果均呈阴性，说明建立的方法能准确区分疫苗株和流行毒株，即使是HCLV同源性很高的经典强毒株Shimen也能准确区分，且疫苗株出现2条条带，流行株仅1条带，比李艳等[9]建立的方法更为直观，易于判断。灵敏度试验表明，检测的cDNA的质量浓度极限为3.4×10-7pg/L，灵敏度明显高于李艳等[9]、 谢金文等[10]的方法，完全满足CSFV临床检测需要。临床应用检测116份疑似CSF的组织及血清等样品，结果有37份样品为阳性。

由于 E2是CSFV主要保护性基因，并且在基因分群中分辨率最高，研究积累也最丰富，欧盟猪瘟参考实验室提供分群参考毒株 E2基因序列，因此，为进一步验证检测方法的准确性，选择 E2基因序列进行分析，以验证该方法。从检测的阳性病料中成功获得11株 E2基因序列，命名为SX01～SX11，GenBank登录号为KM233874～KM233884。采用DNAstar软件比较分析目的序列与参考序列并绘制系统发生树，发现获得的11个 E2基因序列均属Subgroup 2.1，为近年猪瘟流行的优势毒株，同时证实建立的鉴别诊断方法的准确性。

综上所述，本研究建立鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断方法，方法灵敏度高、特异性好，通过电泳图像可直观区分疫苗毒株和流行毒株，为临床检测提供一种有效的诊断手段。

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Received 2015-08-12Returned2015-10-26

Foundation itemThe Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi Province (No. 2014K02-06-03); the Science and Technology Research Program of Xianyang City (No. 2014K02-21).

First author WU Xujin, female, associate professor,Ph.D.Research area:nanometer drug development and animal diseases molecular etiology.E-mail: zhuxiaofu2004@aliyun.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment of a RT-nPCR Method for Detection and Differentiation of Wild-type and Vaccine Viruses of Classical Swine Fever Virus

WU Xujin and ZHU Xiaofu

(Animal Epidemic Disease Diagnostic Laboratory of Molecular Biology, Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xianyang Vocational Technical College, Xianyang Shaanxi712000, China)

AbstractTo establish a method of a reverse transcription-multiplex nested polymerase chain reaction for easy differentiation of classical swine fever vaccine C-strain and wild-type strains, according to the CSFV complete genome sequences in GenBank and some of the wild-type CSFV sequences in Shaanxi province, we designed two universal external expansion primers for the NS5B gene region and two universal internal primers and one special primer of expansion of C-strain, the RT-nPCR diagnostic methods were established for the identification of wild-strain CSFV and C-strain. We acquired 261 bp and 157 bp two bands from C-strain, but only acquired 261 bp band from Shimen, SXYL2006, GX54 and SD2002 other wild-strains by using the RT-nPCR method, and several other common pig virus were negative. The sensitivity test showed that the method detection limit of cDNA content was 3.4×10-7pg/L. 116 clinical samples test results showed that 37 samples were positive, the positive rate was 32%. We analyses some of E2 gene sequence of positive tissues confirmed the accuracy of the test results. The establishment of a reverse transcription-multiplex nested polymerase chain reaction method has high sensitivity, specificity, and can intuitively differentiate between C-strain and wild-strains of CSFV.

Key wordsClassical swine fever; Reverse transcription-polymerase chain reaction complex sets; Differential diagnosis

中图分类号S852.65+1

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)03-0335-07

基金项目：陕西省科学技术研究发展计划(2014K02-06-03)；咸阳市科学技术研究计划(2014K02-21)。

收稿日期：2015-08-12修回日期：2015-10-26

网络出版日期：2016-03-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.006.html

第一作者：吴旭锦，女，副教授，博士，从事纳米药物开发和动物疫病分子病原学研究。E-mail：zhuxiaofu2004@aliyun.com