鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

罗　乐，赵　碧，郑　敏，吴良涛，文　明,2

(1. 贵州大学 动物科学学院，贵阳　550025；2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳　550025)



鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

罗乐1，赵碧1，郑敏1，吴良涛1，文明1,2

(1. 贵州大学 动物科学学院，贵阳550025；2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳550025)

摘要为建立基于鸭源宿主细胞的蛋白激酶PKC基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank数据库的PKC基因设计、合成特异性引物，通过PCR技术扩增目的基因片段，构建重组质粒GV pXT19-T-PKC，并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线，进行重复性、特异性和敏感性验证。结果显示，荧光定量PCR标准曲线为y=-3.334 0x+44.199，相关系数为0.995 4，扩增效率为99.19%；熔解曲线仅出现单特异峰，未检测到H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本的荧光信号。说明，建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。

关键词实时荧光 PCR；蛋白激酶C；SYBR Green Ⅰ

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)是阻碍水禽养殖业发展的重要病原之一[1]。目前，对该病毒的研究虽然取得多方面进展，但其致病机制尚未完全清楚。该病毒主要通过与宿主相互作用而致病，但有关宿主细胞对DEV感染的应答，尤其是病毒蛋白受体的研究较少。贵州大学动物疫病研究室在前期研究中通过构建DEV基因文库，发现并鉴定核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)[2]，随后通过酵母双杂交系统筛选并鉴定核衣壳蛋白在鸭宿主细胞的受体为蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor，PKCI)[3]。

PKCI是PKC在宿主细胞内的抑制蛋白质，也是DEV在宿主细胞内的受体。有研究表明，蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是一类由多基因编码，分子质量约80 ku的多肽类物质，属于Ser/Thr蛋白激酶家族，参与细胞内多种功能的信号转导，如增殖、分化和凋亡等。有学者在研究禽流感病毒[4]、新城疫病毒[5]和博纳病病毒[6]时发现，宿主细胞的蛋白激酶与病毒增殖存在一定关系，即宿主细胞的蛋白激酶通过调节病毒蛋白的磷酸化，影响病毒蛋白分布，进而改变病毒的复制转录过程，但PKCI通过PKC影响DEV增殖的机制尚不清楚。由于实时荧光定量 PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术是当前分析基因表达差异的重要方法，具有实时性、特异性强、准确性和灵敏度高等特点，已广泛应用于生命科学研究的各个领域[7]。因此，有必要建立针对鸭源PKC基因的FQ-PCR检测方法，为进一步研究阐明PKCI及PKC对DEV增殖影响的作用机制奠定基础。

1材料与方法

1.1毒株与细胞

鸭肠炎病毒GZ株(DEV-GZ)，由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供。鸭胚成纤维细胞，由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室通过传统方法制备。

1.2主要试剂

E.coliDH5α，由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供；克隆载体 pMD19-T Vector、胶回收试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)和MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒等，均购自TaKaRa 公司；质粒快速提取试剂盒E. Z. N. A.TMPlasmid Mini Kit，购自Omega公司。

1.3引物设计与cDNA合成

根据GenBank数据库的PKC基因mRNA序列，采用Primer 5.0软件设计PKC基因引物，PKCF：5′-AAAGGATAATGTGGGGTAT-3′；PKCR：5′-TGAAAGACACTGGTGACAC-3′。预扩增片段大小为213 bp，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒提取鸭肝脏组织总RNA，并以此为模板，通过PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒合成cDNA，保存，待用。

1.4PKC标准阳性质粒的制备

1.4.1目的基因扩增与回收采用常规 PCR 方法扩增PKC基因。反应体系：1.0 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，2.5 μL 2×TaqPCR Master Mix反应液，ddH2O补至25.0 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收PCR 产物。

1.4.2重组质粒构建将回收的目的产物连接至PMD-19T载体，并转化至E.coliDH5α，采用含氨苄西林的LB琼脂平板，通过蓝白斑筛选出白色菌落进行大量培养，提取重组质粒GV pXT19-T-PKC，经双酶切和测序鉴定后，将阳性重组质粒GV pXT19-T-PKC作为实时荧光定量PCR标准品。

1.5标准曲线绘制

测定阳性重组质粒的OD260和OD280，计算重组质粒的DNA浓度，并计算质粒拷贝数：拷贝数=(6.02×1023×质粒DNA浓度)/(DNA长×109×660)。

荧光定量PCR标准曲线绘制：取阳性重组质粒作10倍梯度稀释，以不同稀释度阳性重组质粒为模板进行定量PCR反应，通过荧光定量PCR仪测定Ct值。以起始拷贝数为横坐标(x)，Ct值为纵坐标(y)绘制标准曲线。

1.6重复性验证

取1 μL拷贝数为3.52×103～3.52×1010的标准阳性质粒为模板，分别进行3次PCR检测，根据Ct值验证其重复性。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.7敏感性验证

分别以1 μL拷贝数为3.52×100～3.52×101的标准阳性质粒和1 μL拷贝数为3.52×103～3.52×107的标准阳性质粒为模板进行定量PCR反应，验证该方法的敏感性。单位体积拷贝数越小，敏感性越好。PCR反应条件同“1.6”。

1.8特异性验证

选择H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒为参考毒株，提取参考毒株的核酸，验证建立的荧光定量PCR方法的特异性。

2结果与分析

2.1PKC标准阳性质粒的制备

2.1.1目的基因扩增采用引物 PKCF/PKCR，以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到213 bp的目的条带，与理论扩增片段大小一致(图1)，说明已成功扩增获得目的基因。

M. DGL2000 Marker；1.PKC基因扩增产物PKCgene amplified product

图1目的基因PCR扩增结果

Fig.1Result of target gene amplification

2.1.2菌落PCR鉴定蓝白斑筛选培养后，挑取10个白色菌落，以载体引物M13-47/M13-48为菌落引物进行PCR鉴定，结果显示，挑取的菌落为阳性(图2)，说明重组质粒转化成功。

2.1.3质粒PCR鉴定提取构建质粒并进行PCR鉴定和测序，结果显示，获得1条213 bp的目的条带，与理论扩增片段大小一致，说明克隆序列与目的序列的同源性为100%(图3)。

2.2标准曲线绘制结果分析

以1 μL拷贝数为3.52×105～3.52×1010的标准阳性质粒为模板进行定量PCR反应，结果显示，PCR的扩增效率为99.19%，且模板Ct值(y)与起始拷贝数(x)满足关系式：y=-3.334 0x+44.199，该标准曲线的斜率为-3.334 0，相关系数为0.995 4(图4)，结合标准曲线方程可推算出起始拷贝数。

M. DGL2000 Marker；1～10. 菌落PCR产物PCR product ofE.coli

图2菌落PCR鉴定结果

Fig.2Screen PCR results

M. DGL2000 Marker；1. 质粒PCR产物Product of plasmid PCR

图3质粒PCR鉴定结果

Fig.3PCR amplification result of plasmid

2.3重复性验证结果分析

选取1 μL拷贝数为3.52×103～3.52×1010的标准阳性质粒为模板进行3次荧光定量PCR扩增，结果显示，其Ct值的重复性较好，在相同起始拷贝数下，3次重复试验的Ct值与平均值的差值均不超过0.5(表1)，说明建立的荧光定量PCR方法具有较好的重复性。

图4　PKC标准曲线的建立

起始拷贝数InitialcopynumberCt值 Ct-value第1次First第2次Second第3次Third平均值Average3.52×101010.7810.5310.5510.623.52×10914.4014.7514.5914.583.52×10817.8217.6617.6817.723.52×10720.1920.1820.3620.243.52×10625.0324.7424.8624.873.52×10527.2527.2627.1527.223.52×10429.1029.1228.8129.013.52×10335.0035.0035.0035.00

2.4特异性与敏感性验证结果分析

以H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本为模版进行扩增，结果显示，在参考毒株中均未检测到扩增信号，且熔解曲线呈单一峰(图5)，说明建立的荧光定量PCR方法具有良好的特异性。以系列稀释度阳性重组质粒为模板进行定量PCR扩增，发现在3.52个拷贝数模板上能检测到扩增信号(图6-G)，说明建立的荧光定量PCR方法具有较高的敏感性。

图5　熔解曲线

A～E. 3.52×103～3.52×107拷贝数扩增信号3.52×103-3.52×107copies amplification signal；F～G. 3.52×100～3.52×101拷贝数扩增信号3.52×100-3.52×101copies amplification signal；H. 参考毒株Reference strains

图6特异性与敏感性检测

Fig.6Result of specificity and sensibility

3讨 论

荧光定量PCR技术是将DNA荧光结合染料或特异性荧光探针加入PCR反应体系，通过荧光信号强弱实时监测整个PCR过程的一种PCR技术[8]。常用的荧光定量PCR技术有绝对定量PCR和相对定量PCR 2种。绝对定量PCR法一般是通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，然后在相同的条件下检测目的基因的荧光信号量，再根据标准曲线计算目的基因的绝对量[9]；而相对定量PCR方法是计算一定样本中靶序列相对于参照基因量的变化量，再根据通过基因与参照基因的比值反映目的基因的变化[10]。目前，FQ-PCR方法是常用的相对定量PCR技术，已广泛应用于家畜、家禽和水产动物等病原的快速检测，并取得较好的应用效果[11-13]。

选择荧光染料是建立相对定量PCR方法的关键。SYBR GreenⅠ荧光染料可以与双链DNA特异结合，荧光信号强弱与PCR产物的量呈正相关，且应用简便，无需设计探针，可降低检测成本，但该荧光染料也可与非特异DNA片段结合产生假阳性信号，因此，在优化反应条件时需结合熔解曲线分析软件检测是否存在引物二聚体干扰。本研究选择SYBR GreenⅠ作荧光染料，且在检测其熔解曲线时发现，整个过程只出现单一波峰，说明建立的SYBR Green I 荧光定量PCR方法无假阳性信号。

相关系数、斜率值和扩增效率是衡量实时荧光定量PCR方法优劣的重要指标。理想的实时荧光定量PCR方法建立的曲线的相关系数接近1，斜率值为-3.5～-3.0，扩增效率为90%～110%，而本研究建立的鸭源PKC基因实时荧光定量PCR方法，其曲线的相关系数为0.996 4，斜率为-3.334 0，扩增效率为99.19%，说明该方法达到实时荧光定量PCR标准要求，可用于后续研究。

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Received 2015-07-15Returned2015-10-25

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No. 31260607,31560703); the Guizhou Youth Science and Technology Foundation (Grant No.Qiankehe Renzi[2013]25th); Guizhou Science and Technology Innovation Talents Team(Grant No.Qiankehe Talents Team[2015]4016th).

First authorLUO Le, male, master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:499639895@qq.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment of Real-time Fluorescence Quantitative PCR Method for DetectingPKCGene in Duck

LUO Le1, ZHAO Bi1, ZHENG Min1, WU Liangtao1and WEN Ming1,2

(1. Colleg of Animal Science, Guizhou University, Guiyang550025, China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Veterinary Public Health of Guizhou Province, Guiyang550025, China)

AbstractTo develop a SYBR GreenⅠ Real-Time PCR method assay for detecting the PKC gene in duck, the specific primers were designed and synthesized accorded to the PKC gene in the GenBank. and the target gene fragment obtained by PCR. Then the recombinant plasmid GV pXT19-T-PKC were constructed. The real-time fluorescent quantitative PCR method and the standard curve were established, then analyzed its reproducibility, specificity and sensitivity. The linear relationship of standard curve was y=-3.334 0x+44.199, and the correlation coefficient was 0.995 4, the amplification efficiency was 99.19%. There were a single specific peak appeared in the melting curve, and the fluorescence signal were not detected in the H5, H7, and H9 subtype of avian influenza virus, Newcastle disease virus and duck hepatitis virus.All the results indicated the Real-Time fluorescent quantitative PCR method for PKC gene in ducks is excellent stability, specificity and sensitivity.

Key wordsFluorescence quantitative PCR; Protein kinase C; SYBR GreenⅠ dye

Corresponding authorWEN Ming, male,Ph.D,professor.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:as.mwen@gzu.edu.cn

中图分类号S852.4

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)03-0342-05

通信作者：文明，男，博士，教授，从事兽医微生物学与免疫学研究。E-mail：as.mwen@gzu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(31260607；31560703)；贵州省优秀青年科技人才培养计划[黔科合人字(2013)25号]；贵州省科技创新人才团队[黔科合人才团队(2015)4016号]。

收稿日期：2015-07-15修回日期：2015-10-25

网络出版日期：2016-03-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.008.html

第一作者：罗乐，男，硕士研究生，研究方向为兽医微生物学与免疫学。E-mail：499639895@qq.com