一株传染性造血器官坏死病毒的分离鉴定和系统进化分析

何亚鹏 ，刘宁 ，陈春山 ，李博 ，魏凯 ，时晓 ，郭玉丹 ，韩姝伊 ，杜迎春

（1.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100；2.石河子大学，新疆 石河子 832000；3.河北师范大学，河北 石家庄 050024）

传染性造血器官坏死病（Infectious haematopoietic necrosis，IHN）是鲑鳟等冷水鱼类的急性全身性传染病，是世界动物卫生组织（OIE）规定必须申报的动物疫病，我国农业部将其列为二类动物疫病，是第I类鱼类口岸检疫疫病[1]。IHN在法国、意大利、德国、英国、日本、韩国、俄罗斯和中国等国家暴发；1985年中国东北地区首次报道IHN，目前该病在北京、河北、辽宁、吉林、山东、甘肃、青海、四川、新疆、云南等省、市、地区均有分布，并有向周围蔓延的趋势[2-4]。IHN的病原为弹状病毒科、诺拉弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）。IHNV 呈子弹状，有囊膜包被[4]。根据基因的差异，IHNV可分为5个基因型，分别为 U、M、L、E 和 JRt，其中 JRt基因型主要分布于中国、日本和韩国等亚洲地区[5-7]。IHNV主要危害鲑鳟类的鱼苗及幼鱼，鱼苗死亡率极高，可达100%[1,3]。我国近几年冷水鱼养殖发展迅速、前景广阔，需警惕IHNV的威胁，及时做好防控。

本研究于2018年3月从河北省某冷水鱼场的发病虹鳟鱼苗体内分离到1株病毒，经回归感染、RT-PCR检测及系统进化分析等鉴定，该病毒为IHNV。通过研究其致病性及与其他IHNV毒株的相似性和进化关系，旨在研究新分离毒株的传播特点，并为中国传染性造血器官坏死病的预防和疫情监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和细胞

发病死亡的虹鳟鱼苗样品采自河北省某冷水鱼养殖场；鲤上皮细胞（Carp epithelial cell，EPC）由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

MEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）购自赛默飞世尔科技有限公司；RNA提取试剂盒购于北京康润诚业生物科技有限公司；反转录试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司；DNA Marker、2×Es Taq Master-Mix购于北京康为世纪生物科技有限公司；核酸胶回收试剂盒、克隆载体pEASY-T1 Cloning Kit、克隆感受态细胞Trans5α、质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。试验所用引物由华大基因公司合成，RT-PCR检测所用外引物序列为IHN-Nf786：TCAAGGGGGGAGTCCTCGA，IHN-Nr78 6：CACCGTACTTTGCTGCTAC；内引物序列为 IHNNa323：TTCGCAGATCCCAACAACAA，IHN-Nb323：GCGCACAGTGC CTTGGCT[8]；G基因扩增引物序列为 IHN-GF：ATGGACGCCATGATCACCACT；IHNGR：TTAGGACCTGTTTGCCAGGTGATAC。

1.2 病毒的细胞培养

取患病鱼肝脏、脾脏等组织加适量PBS液研磨，所得研磨液置于-80℃冰箱内反复冻融3次，8 000 r/min离心5min，取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。将上述处理好的样品稀释100倍后接种于EPC单层细胞，在15℃的细胞培养箱中培养。每日定时观察细胞的病变情况，当约80%的细胞出现病变后收集病变细胞液，保存于-80℃冰箱中。

1.3 回归感染

选取100尾体质量约10g的虹鳟随机分成两组，每组50只。在约15℃的恒温循环水池内饲养15d，观察无病症，然后进行人工感染试验。实验组虹鳟注射0.25mL病变细胞液，对照组虹鳟注射等量PBS溶液。每日记录攻毒虹鳟的死亡情况，连续观察10d，收集部分病死虹鳟样品。

1.4 套式RT-PCR鉴定

取自然感染的病鱼组织研磨液上清、病变细胞液和攻毒后死亡虹鳟的组织研磨液上清各200 μL，用RNA提取试剂盒提取RNA，进行反转录，以反转录产物为模板，根据国家标准GB/T 15805.2-2008的方法进行IHNV的套式PCR检测。外引物为IHN-Nf786和IHN-Nr786，内引物为IHN-Na323和IHN-Nb323，以水为模板设阴性对照组。

1.5 G基因的克隆与系统进化分析

取检测为IHNV阳性样品的RNA进行反转录，以反转录产物为模板，利用引物IHN-GF、IHN-GR进行常规PCR，扩增该毒株的表面糖蛋白G基因序列，胶回收目的条带，连接T载体，转化，提取质粒，进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的质粒送天一辉远生物公司进行测序，将测序结果上传至NCBI。在Genbank下载IHNV典型毒株序列，用Mega X软件构建系统进化树。系统进化分析参考的毒株为XJ-13 2013（JRt型）、Auke77（U 型）、Col-80（L 型）、Fn6433（M型）和Fft121-07h（E型）等。

2 结果与分析

2.1 剖检症状

幼鱼体表发黑，腹部膨大，肛门流出淡黄色黏液便。体表两侧、尾部和鳍条基部充血（图1a中箭头所示），解剖后可见腹膜严重出血，肠道充血（图1b中箭头所示），胃和肠道内有透明黏液，炎症和出血症状符合急性传染病的临床特征，细菌学检验未从发病鱼的肝脏和脾中分离到细菌，结合该渔场中虹鳟发病率和死亡率高的特点，初步怀疑患病鱼为病毒感染。

图1 病鱼临床特征Fig.1 Clinical signs of diseased fish

2.2 病毒的分离结果

接种组织悬液72h后EPC细胞开始收缩变圆，出现明显细胞病变；120h后细胞呈网状，出现空斑，脱落，而对照组细胞状况良好。收集病变细胞液进行后续回归感染实验和检测。

2.3 鱼体回归感染实验

实验组虹鳟注射病变细胞液感染第3 d开始出现死亡，10 d累计死亡率达72%，主要表现为急性死亡，症状和自然发病鱼相同，对照组虹鳟无异常，全部存活（图2）。

图2 病变细胞液人工感染试验结果Fig.2 Results of artificial infection test with pathological cell fluid

2.4 套式RT-PCR扩增结果

套式RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示自然感染的虹鳟鱼苗、病变细胞液和攻毒后死亡虹鳟样品第一次PCR分别出现786 bp的目的条带（图3a），第二次PCR分别出现323 bp的目的条带（图3b），与IHNV预期大小一致，阴性对照无明显条带。RT-PCR鉴定结果表明，自然感染的虹鳟鱼苗、收集的病变细胞液、攻毒后死亡的虹鳟鱼苗样品均为IHNV阳性。

图3 PCR检测结果Fig.3 Result of PCR detection

2.5 IHNV分离株糖蛋白基因的系统进化分析

将鉴定为阳性的质粒成功测序后，获得糖蛋白G基因全长，将序列上传至Genbank，登录号为MH374162，毒株名为IHNV-BJSY。从Genbank下载IHNV的5种基因型的G基因序列：XJ-132013（JRt型）、Auke77（U 型）、Col-80（L 型）、Fn6433（M 型）、Fft121-07h（E型）等，与IHNV-BJSY株进行核苷酸序列比对。结果表明，IHNV-BJSY株和其余参考毒株G基因核苷酸序列长度均为1 527 bp，对分离株与IHNV参考毒株G基因的核苷酸序列进行同源性比较，发现IHNV-BJSY株与中国、韩国以及日本参考毒株之间的核苷酸同源性高，和国内分离株XJ-13株、GS2014株相似性达到99%，同属于JRt型（图 4）。

图4 IHNV G基因系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of nucleic acid sequence within G gene from IHNV

3 讨论

近年来，IHN在我国多地的冷水鱼养殖场持续爆发，由我国东北、东部、中部各省市向西北、西南各省蔓延，对冷水鱼养殖造成严重威胁[1,3]。冷水鱼在水温在10℃左右时最易感染，水温在15℃以上发病率明显降低。IHNV感染后，鲑鳟一般会出现典型的临床症状，表现为体色发黑、腹部膨大、肛门外拖有粪便，剖检可见胃肠道内充满白色或淡黄色乳状液体，肝脏、脾、肾贫血苍白，一般还伴随腹膜、肠系膜等充血[3]。本次发病虹鳟体色发黑，腹部膨大，体表、腹膜和肠道充血等临床症状与之前IHN的报道基本一致，进而进行病毒分离试验。大马哈鱼胚胎细胞（Chinook salmon embryocells，CHSE-214）和虹鳟性腺细胞（Rainbow trout gonadal cell line，RTG-2）相比，EPC对IHNV的敏感性更高，最适合IHNV体外培养。因此，本研究利用EPC进行IHNV分离和增殖，保证最好的病毒活力，收集的病变细胞液在回归感染中毒力强，攻毒10d累计死亡率达72%，和其他强毒株相当。本试验根据国家标准采用套式RT-PCR方法进行IHNV检测，结果自然感染的病鱼、病变细胞液和攻毒后死亡虹鳟样品均为IHNV阳性，证实该患病虹鳟的病原是IHNV。

根据基因差异，IHNV可分为5个基因型，分别为 U（upper）、M（middle）、L（lower）、E（Europe）和 JRt（Japanese rainbowtrout）[9,10]。最早报道的毒株基因型为U、M、L，主要分布在北美，欧洲爆发的毒株主要为E基因型。在亚洲地区，日本最先报道该病，刚开始流行的毒株主要为U基因型，近年来在日本发现1个新的基因型JRt[11,12]。G基因系统发育分析表明，IHNV-BJSY株和其他众多中国分离株均为JRt基因型；同源性分析表明，我国分离株与韩国株及日本株具有相对最高的核酸同源性。结合我国流行毒株的基因型和上世纪末中国从日本引进虹鳟受精卵的史料分析，中国IHN的爆发极有可能和从日本引入虹鳟受精卵有关。

IHNV是严重危害鲑鳟鱼类的病毒，对鱼苗致死率极高，一旦爆发，难以控制。如果IHN在我国冷水鱼养殖地区长期流行，势必蔓延发展，产生严重危害，制约我国鲑鳟养殖业的发展。许多国家和地区均因鱼卵检疫不严而传入该病，我国应进一步完善鲑鳟良种场的职能，对苗种场等进行持续监测，促进其生产出优质无污染的发眼卵，对引进的鱼卵和种鱼进行严格的检疫，从源头上控制IHN的扩散，净化我国鲑鳟养殖场，保障鲑鳟养殖业的繁荣发展。