耐酸产蛋白酶芽孢杆菌SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽条件的优化

周星华，董伟洁，姜军坡,2，刘 双，王世英，朱宝成

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001； 2.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071001；3.河北省畜牧站，河北 石家庄 050011)

大豆肽是大豆蛋白经水解产生的低分子肽混合物，不仅具有易消化吸收、加热不凝固、易溶于水等优良特性，还具有低氧化性、低过敏性和低抗原性等生理活性，并且能够降血压、血脂和胆固醇以及调节血糖浓度[1]，可在蛋鸡和肉鸡体内发挥免疫和抗氧化功能，提高其生产性能[2]。

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacines)的同源性极高，具有可利用甲醇等非C-C键低碳化合物的特点，首次被报道于2010年[3]，研究者发现其具有产抗菌蛋白[4]、降解黄曲霉毒素[5]、抑制植物病原菌[6-7]等多种功能。

前期试验以酸性脱脂牛奶培养基为限制性培养基，筛选到1株耐受酸性环境且产酸性蛋白酶活力较高的甲基营养型芽孢杆菌SD48菌株，并且优化了SD48菌株固体发酵豆粕的条件，发酵后的豆粕pH值显著降低，其酸溶蛋白相对含量和抗氧化活性显著提高，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白接近完全降解，豆粕的营养价值得到了极大提高[8]。鉴于此，本研究以大豆肽含量为指标，通过单因素试验和正交试验确定SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽的最优培养基组成和最佳发酵条件，以期为发酵豆粕产高含量大豆肽的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 甲基营养型芽孢杆菌SD48菌株由河北农业大学制药工程系实验室分离并保存。

1.1.2 试剂与培养基 膨化豆粕由中储粮油脂(唐山)有限公司生产(粗蛋白≥(43.0±0.5)%，水分≤13.0%)。NB培养基、NA培养基、TPTZ工作液的配制方法参照文献[8]；基础发酵培养基的配制：豆粕10.000 g、Na2HPO40.840 g、KH2PO40.032 g，水100 mL，自然pH值。

1.2 试验方法

1.2.1 豆粕发酵液中蛋白质和游离氨基酸含量的测定 将豆粕发酵液充分混匀后取1.0 mL，加入到300 mL消解管中，再加入1.5 mL超纯水，然后采用凯氏定氮法测定豆粕发酵液中粗蛋白含量。再吸取1.5 mL充分混匀后的豆粕发酵液加入10 mL 15%三氯乙酸，振荡60 min，于5 000 r/min离心20 min，然后吸取3 mL上清液于消解管中，采用粗蛋白含量测定法测定酸溶蛋白含量。

采用茚三酮法测定游离氨基酸含量。首先分别取不同浓度的赖氨酸标准品溶液1.5 mL，加入10 mL 15%三氯乙酸，于4 000 r/min离心20 min后取上清液5 mL，加入1 mL 1%茚三酮溶液，沸水浴8 min。冷却后，用无水乙醇定容至10 mL，于450 nm下测定吸光度。以水代替赖氨酸溶液同法操作，所得溶液用来调零。根据测定结果以吸光度为纵坐标，以赖氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。以相同的方法处理豆粕发酵液，并根据测定结果，结合茚三酮法测定赖氨酸浓度的标准曲线，计算豆粕发酵液中游离氨基酸的浓度(mmol/L)。游离氨基酸含量(X，%)的计算如下：

X=(x×128)/10 000

式中，x为结合标准曲线计算出的豆粕发酵液中游离氨基酸的浓度(mmol/L)，128为赖氨酸摩尔质量。

1.2.2 豆粕发酵液中大豆肽含量的测定 由1.2.1中测定出的酸溶蛋白含量与游离氨基酸含量的差值，即为豆粕发酵液中大豆肽的含量。大豆肽相对含量为发酵豆粕中大豆肽与粗蛋白含量的比值。

1.2.3 豆粕发酵液中蛋白质分子质量分布测定 吸取充分混匀后的豆粕发酵液1 mL于10 000 r/min离心10 min，取40 μL上清液，加入5×上样缓冲液10 μL，进行10 min的沸水浴，然后于12 000 r/min离心5 min，得到待测液后根据文献[8]测定蛋白质分子质量分布。对照组除不添加种子液外，其余同试验组。

1.2.4 豆粕发酵液的抗氧化活性测定 抗氧化活性测定方法参照文献[8]，标准曲线方程如下：

y=2.292 7x-0.035 2(r2=0.999 4)。

豆粕发酵液与15%三氯乙酸按1∶1比例浸提，于4 000 r/min离心20 min后，取100 μL上清液加入3 mL TPTZ工作液，混合均匀后于35 ℃水浴30 min，在597 nm处测定吸光度。以水代替维生素C溶液同法操作，用来调零。豆粕发酵液的抗氧化活性以μg AEAC/mL(每1 mL豆粕发酵液的抗氧化能力相当于1 μg维生素C的抗氧化能力)表示。豆粕发酵液的抗氧化活性(Y，μg AEAC/mL)的计算如下：

Y=(y×176.2×n)/10 000

式中，y为标准曲线中的维生素C的浓度(mmol/L)，n为稀释倍数，176.12为维生素C的摩尔质量。

1.2.5 SD48菌株种子液的制备 SD48菌株种子液的制备方法同文献[8]。

1.2.6 SD48菌株液体发酵产大豆肽培养基组成的优化 碳源种类的选择：在基础发酵培养基中分别添加2.00%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉和糊精，配制成含有不同碳源的发酵培养基，SD48菌株的接种量均为6.00%，于37 ℃、180 r/min培养48 h后分别测定粗蛋白、酸溶蛋白、游离氨基酸含量，最后以大豆肽含量作为指标，筛选出最适碳源。

无机盐种类的选择：在基础发酵培养基中加入上述所得2.00%的最适碳源，然后分别加入0.05%的MgSO4、ZnSO4、MnSO4、KCl、NaCl、FeCl3等无机盐，共配制6种不同的发酵培养基，在上述发酵条件下，筛选出最适无机盐。

培养基组成的正交试验优化：以大豆肽含量为指标，按正交试验表L9(34)设计四因素三水平试验，对碳源、氮源、硫酸铵以及无机盐含量进行优化，正交试验因素水平见表1。根据其配制发酵培养基，SD48菌株的接种量均为6.00%，于最适发酵温度下以180 r/min摇床培养48 h，然后以大豆肽含量为指标，对正交试验结果进行极差分析，从而得到最优发酵培养基组成。

1.2.7 培养温度对SD48菌株发酵产大豆肽的影响试验 在基础发酵培养基中加入2.00%的最适碳源和0.05%的最适无机盐，分别在28、30、35、37 ℃条件下以180 r/min摇床培养48 h，得出最佳的培养温度。

表1 SD48菌株液体发酵培养基组成的正交优化试验因素水平 Tab.1 Level of factors for orthogonal optimization of liquid fermentation medium composition of SD48 strain %

1.2.8 SD48菌株液体发酵产大豆肽培养条件的正交优化试验 以大豆肽含量为指标，按正交试验表L9(34)设计四因素三水平试验，对接种量、发酵时间、起始pH值以及装瓶量进行优化，正交试验的因素水平如表2所示。以大豆肽含量为指标，对正交试验结果进行极差分析，得出最佳的发酵培养条件。

表2 SD48菌株液体发酵培养条件的正交优化试验因素水平Tab.2 Level of factors for orthogonal optimization of liquid fermentation conditions of SD48 strain

2 结果与分析

2.1 豆粕发酵液中游离氨基酸浓度测定的标准曲线

由图1可知，通过茚三酮法测定豆粕发酵液后，得到游离氨基酸浓度线性方程为y=0.004 2x+0.055 6，r2=0.991 4。游离氨基酸浓度在0～150 mmol/L，具有良好线性。

图1 茚三酮法测定赖氨酸浓度的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of lysine concentration by ninhydrin method

2.2 碳源对大豆肽产量的影响

由表3可知，当碳源为蔗糖、玉米粉和乳糖时，发酵液中不含大豆肽；当碳源为甘露醇、葡萄糖和糊精时，大豆肽含量分别为0.24%、0.53%、0.50%；当碳源为可溶性淀粉时，大豆肽含量为0.70%。故选择淀粉作为最适碳源，此时，大豆肽相对含量为11.27%。

表3 碳源对SD48菌株发酵豆粕产大豆肽的影响Tab.3 Effects of carbon sources on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.3 无机盐对大豆肽产量的影响

由表4可知，分别以MgSO4、ZnSO4、KCl、NaCl和FeCl3作为无机盐时，大豆肽含量在1.36%～1.91%。当无机盐为MnSO4时，大豆肽含量最高，为2.18%，故选择MnSO4作为最适无机盐，此时，大豆肽相对含量为34.88%。

表4 无机盐对SD48菌株发酵豆粕产大豆肽的影响Tab.4 Effect of inorganic salts on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.4 SD48菌株液体发酵培养基组成的正交优化试验结果

由表5—6可知，影响SD48菌株发酵豆粕产大豆肽含量的培养基组成依次为豆粕含量>硫酸铵含量>无机盐含量>可溶性淀粉含量，综合分析得到最佳组合为A2B3C3D3(可溶性淀粉2.00%、豆粕15.00%、硫酸铵4.00%、无机盐0.09%)。将A2B3C3D3组与正交试验中表现最佳的组合A1B3C3D3(可溶性淀粉1.00%、豆粕15.00%、硫酸铵4.00%、无机盐0.09%)进行比较发现，A1B3C3D3组大豆肽含量较高，此条件下SD48菌株液体发酵产大豆肽的含量为5.52%，大豆肽相对含量为54.06%，发酵产物的抗氧化活性为557.90 μg AEAC/mL(表7)。

2.5 温度对大豆肽产量的影响

由表8可知，当发酵温度为30 ℃时，豆粕发酵液中大豆肽含量最低，为2.87%；此时酸溶蛋白含量最低，为4.45%；但游离氨基酸含量最高，为1.58%。当发酵温度为35 ℃时，豆粕发酵液中大豆肽含量为3.34%。当发酵温度为28 ℃和37 ℃时，豆粕发酵液中大豆肽含量较高，分别为3.68%和3.56%，大豆肽相对含量分别为56.79%和56.24%，此外，考虑到发酵温度较低时耗能较少，故选择28 ℃作为SD48菌株发酵豆粕的最适温度。

表5 SD48菌株液体发酵培养基组成的正交优化试验结果(部分)Tab.5 Orthogonal optimization of medium composition for liquid fermentation of SD48 strain (Part)

表6 SD48菌株液体发酵培养基组成的正交优化试验结果极差分析Tab.6 Range analysis of orthogonal optimization test on composition of liquid fermentation medium of SD48 strain %

表7 SD48菌株液体发酵培养基组成的正交优化试验结果验证Tab.7 Verification of the results of orthogonal test on liquid fermentation medium composition of SD48 strain

表8 温度对SD48菌株发酵豆粕产大豆肽的影响Tab.8 Effect of temperature on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.6 SD48菌株液体发酵培养条件优化正交试验结果

由表9—10可知，影响SD48菌株发酵豆粕产大豆肽含量的培养条件依次为接种量>发酵时间>装瓶量>pH值，综合分析得到最佳组合为E5F6G5H5(接种量6.00%、培养时间72 h、pH值为6.00、装瓶量为40%)。将E5F6G5H5组与正交试验中大豆肽相对含量最高的组合E5F6G4H5(接种量6.00%、培养时间72 h、pH值为5.00、瓶装量为40%)进行比较发现，E5F6G5H5组对应的大豆肽含量更高，所产大豆肽含量为8.03%，大豆肽相对含量71.06%，抗氧化活性为343.70 μg AEAC/mL(表11)。与仅向基础培养基中加入可溶性淀粉作为碳源所得结果相比，大豆肽含量提高了10.47倍。

2.7 SD48菌株豆粕发酵产物的蛋白质分子质量分布分析

如图2所示，对照组发酵豆粕中蛋白质的分子量主要分布于72、53、43、34、20 ku，其中存在β-伴大豆球蛋白(7S)的α亚基(72 ku)、β亚基(53 ku)以及大豆球蛋白(11S)的酸性多肽链(34 ku)和碱

表9 SD48菌株液体发酵培养条件的正交优化试验结果(部分)Tab.9 Orthogonal optimization of liquid fermentation conditions of SD48 strain (Part)

表10 SD48菌株液体发酵培养条件的正交优化试验结果极差分析Tab.10 Range analysis of orthogonal optimized culture conditions of SD48 strain in liquid fermentation %

表11 SD48菌株液体发酵培养条件的正交优化试验结果验证Tab.11 Verification of the results of orthogonal optimization on liquid fermentation culture conditions of SD48 strain

1：蛋白质分子质量标准；2：空泳道；3：空白对照组；4—6：由E5F6G5H5组发酵豆粕所得的蛋白质；7、8：由E5F6G4H5组发酵豆粕所得的蛋白质

1: Protein Marker; 2: Lane without sample; 3: Control group; 4—6: Proteins from fermented soybean meal of E5F6G5H5group; 7,8: Proteins from fermented soybean meal of E5F6G4H5group

图2 SD48菌株液体发酵豆粕最佳条件下蛋白产物的分子质量分布
Fig.2 Molecular weight distribution of the products of SD48strain under the optimum conditions of liquid fermentationof soybean meal

性多肽链(20 ku)，表明对照组发酵豆粕中主要的抗营养因子没有被消除。但经SD48菌株发酵72 h后，由E5F6G5H5组和E5F6G4H5组发酵豆粕所得蛋白质的条带较浅，说明β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白多数被降解。由E5F6G5H5组发酵豆粕所得的蛋白质较由E5F6G4H5组所得的蛋白质条带在20～72 ku区域内更浅一些，这说明以E5F6G5H5组作为发酵条件进行发酵时，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的降解效果更好。此外，在小于10 ku的区域内，由E5F6G5H5组发酵豆粕所得蛋白质的条带较E5F6G4H5组所得蛋白质的条带(呈弥散状)颜色更深，这说明以E5F6G5H5组作为发酵条件时，豆粕发酵液中含有较多的大豆肽。

3 结论与讨论

大豆肽的氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸平衡良好且含量丰富。大豆肽可有效提高家禽的抗氧化水平和免疫性能，可提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比，提高蛋品质，也可有效提高肉鸡体质量、胸肌率和腿肌率[2]。

为了提高液体发酵豆粕生产大豆肽的产量和转化率，国内外研究者对发酵菌种及工艺进行了广泛研究，发酵豆粕所使用菌种可以划分为曲霉、芽孢杆菌以及混合菌种3种类型。当选用曲霉为菌种时，大豆肽的含量和转化率较低，例如秦思思等[9]利用米曲霉(A.oryzae)A-9005发酵豆粕，在最优条件下，发酵液中大豆肽的转化率达到55.60%，大豆肽含量为16.68 mg/mL。当选用芽孢杆菌为菌种时，液体发酵豆粕所获得的大豆肽含量和转化率主要取决于发酵菌株和工艺条件。一些研究者利用普通芽孢杆菌液体发酵豆粕时，所获得的大豆肽含量为13.51～16.47 mg/mL，与曲霉的发酵效果相比并没有显著差异[10-12]；但当采用优良的芽孢杆菌菌株并为其提供适宜的发酵条件时，即可获得较高产量的大豆肽，例如在最优条件下利用芽孢杆菌液体发酵豆粕，可获得23.60～39.47 mg/mL的大豆肽[13-17]。此外，以曲霉和芽孢杆菌组成的混合菌种发酵豆粕时，并没有表现出显著优势[18]。

本研究采用单因素和正交试验优化大豆肽产生条件，在优化氮源时，豆粕的添加量最多达到15.00%，此时发酵培养基成黏稠状态，若豆粕含量高于15.00%，发酵培养基不再呈液体状，而呈半固体状态。发酵条件优化后，发酵豆粕中大豆肽含量为8.03%，与仅向基础培养基中加入可溶性淀粉作为碳源所得结果相比提高了10.47倍，此时大豆肽相对含量为71.06%，抗氧化活性达到343.70 μg AEAC/mL，极大地提高了液体发酵豆粕中的大豆肽含量和抗氧化活性。

综上，本研究获得了甲基营养型芽孢杆菌SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽的最优培养基组成，利用其发酵豆粕后，可大幅度提高大豆肽的含量及抗氧化活性，为高含量大豆肽发酵豆粕在蛋鸡、肉鸡养殖中的应用奠定了基础。