潞党参对环磷酰胺诱导蚕豆根尖的抗突变作用

秦永燕，赵青松，刘 晨，刘建军，刘瑞祥

(长治学院 生物科学与技术系，山西 长治 046011)

随着生活水平的提高，人们对饮食和保健越来越重视，在摄取食物、补充营养的同时，对提高自身机体免疫力也愈加重视。中药材因副作用小、纯天然，成为养生保健的首选。中药党参(Codonopsispilosula)为桔梗科党参属多年生草本植物，主要分布于山西、陕西、宁夏等地。其中，产自山西省长治地区的党参为潞党参，为山西道地药材之一[1]。党参作为一种滋补药，其主要成分有多糖、生物碱和党参苷等，具有免疫调节、抗疲劳和抗癌等功效[2-3]。目前，对党参的研究主要集中在化学成分和生物活性等方面，对其抗突变作用的研究主要以小鼠为对象。张涛等[4]利用小鼠研究发现，党参多糖中CPNP-2具有良好的抗衰老作用。史宝忠等[5]研究表明，党参多糖能够有效提高小鼠巨噬细胞Ana-1的免疫活力，增强小鼠的免疫功能。许朋等[6]发现，党参多糖可以改善由环磷酰胺所致免疫功能低下大鼠的胸腺指数、脾脏指数，从而增强其免疫功能。但以植物为材料分析潞党参抗突变作用的研究鲜见报道。

蚕豆根尖细胞微核检测技术由DEGRASSI等[7]建立，具有成本低、试验周期短、操作简便、结果可靠、灵敏度高等优点，为诱变剂及药物检测提供了良好的方法[8-10]。丁燕等[11]利用蚕豆根尖细胞微核检测技术研究了丹参的抗突变活性。因环磷酰胺是一种有效的免疫抑制剂，在临床上常用作抗肿瘤药物，其途径是通过抑制细胞DNA合成，干扰细胞增殖，抑制抗体形成等，已广泛应用于免疫抑制[12-13]试验中。因此，采用蚕豆根尖微核技术及生理指标测定方法，研究潞党参对环磷酰胺诱导蚕豆根尖遗传损伤的抗突变作用，为潞党参的开发及应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

蚕豆(Viciafaba)为青皮蚕豆，购自山东省菏泽市鄄城县种子公司。

环磷酰胺(Cyclophoshomide，CP)为上海华联制药有限公司生产，用蒸馏水配制成30 mg/L。

潞党参(Codonopsispilosula)购自山西省长治市平顺药材种植基地。

潞党参水提取液的制备：潞党参晾干，打磨成粉，称取50 g，加入约200 mL蒸馏水，浸泡1 h，煮沸浸提1 h，期间不断用玻璃棒搅拌，防止过沸，过滤掉滤渣；重复提取2次，合并滤液浓缩、定容到100 mL，使其终质量浓度为0.5 g/mL，于冰箱中贮存备用[14]。

测定SOD活性和MDA含量的试剂盒编号分别为BC0170和BC0025，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要仪器

BSA 124S-CW电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司，TGL-20M高速冷冻离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司，723N可见光分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司，Spectra Max M2 多功能酶标仪购自美谷分子仪器(上海) 有限公司，恒温培养箱SPX-250B-Z购自上海博迅实业有限公司，显微镜Panthera L购自麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3 蚕豆根尖培养

挑选大小均匀、表皮完整的蚕豆种子，洗净后于蒸馏水中浸泡24 h，期间换水1次，待种子充分吸水、种皮胀破后，置于铺有湿棉花的托盘中，25 ℃恒温培养箱中催芽。待主根长至1～2 cm时，剪掉根尖生长点，诱导次生根产生。待次生根长度为1～2 cm时，选取长势一致的蚕豆置于30 mg/L环磷酰胺中染毒处理12 h，以蒸馏水培养为阴性对照，记作CK0，然后用不同质量浓度(0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL)潞党参水提液进行恢复培养12 h，各处理分别记作T1、T2、T3、T4、T5，并设蒸馏水恢复培养为阳性对照，记作CK1。

1.4 蚕豆根尖微核试验

用蒸馏水冲洗并剪取根尖，于Carnoy固定液中固定12～24 h，然后移至70%乙醇中，置于冰箱中保存，备用。常规压片镜检，每个处理选取5个根尖，每个根尖观察1 000个分生区细胞，统计其微核数，计算微核率(MCN)，MCN=(样品的微核数×样品观察到的细胞数)×1 000‰。

1.5 生理指标测定

剪取1.3中培养的蚕豆根尖，采用比色法测定还原糖含量；采用α-萘胺法测定根系活力；采用试剂盒测定 SOD活性和MDA含量。

1.6 数据处理

每个处理至少重复3次，试验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 11.5进行数据分析，并用t检验进行组间差异检验。

2 结果分析

2.1 潞党参对蚕豆根尖微核率的影响

以不同质量浓度潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺处理的蚕豆根尖进行恢复培养，根尖微核率的变化见表1。由表1可知，随着潞党参质量浓度的增加，微核率呈先下降后上升的趋势，但各处理微核率均低于阳性对照，差异显著(P<0.05)。当潞党参质量浓度为0.10 g/mL时，微核率最低，为8.61‰，与阴性对照差异不显著(P>0.05)，显著低于阳性对照(P<0.05)，抑制率为46.98%，说明0.10 g/mL潞党参可显著抑制环磷酰胺诱导的蚕豆根尖微核产生。当潞党参质量浓度高于0.10 g/mL时，微核率逐渐增加，抑制率逐渐下降，抑制作用逐渐减弱。组间差异分析表明，潞党参质量浓度为0.05 g/mL和0.15 g/mL处理，蚕豆根尖微核率差异不显著(P<0.05)。根据微核率与污染程度的判定标准[15]，阳性对照30 mg/L的环磷酰胺为轻度污染，经0.10、0.15 g/mL潞党参水提液处理后，可以将轻度污染降为基本没有污染，说明该质量浓度潞党参水提液抗突变作用效果显著。

表1 潞党参对蚕豆根尖微核率的影响 Tab.1 Effect of Codonopsis pilosula on micronucleus rate of Vicia faba root tip

2.2 潞党参对蚕豆根尖还原糖含量的影响

以不同质量浓度潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺处理的蚕豆根尖进行恢复培养，根尖还原糖含量的变化见表2。由表2可知，随潞党参质量浓度增加，蚕豆根尖还原糖含量呈先上升后下降再上升趋势，但均显著高于阴性对照和阳性对照(P<0.05)。当潞党参质量浓度为0.01 g/mL时， 还原糖含量较低；当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，还原糖含量最高，为2.81%，是阴性对照的1.95倍，是阳性对照组的2.75倍。说明潞党参能显著增加蚕豆根尖的还原糖含量，这可能是由于潞党参的主要成分是党参多糖，蚕豆根尖吸收后自身将其分解成还原糖造成的。

表2 潞党参对蚕豆根尖还原糖含量的影响 Tab.2 Effect of Codonopsis pilosula on reducing sugar content of Vicia faba root tip

2.3 潞党参对蚕豆根系活力的影响

以不同质量浓度潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺处理的蚕豆根尖进行恢复培养，根尖根系活力的变化见表3。由表3可知，随着潞党参质量浓度的增加，蚕豆根尖根系活力呈先上升后下降再上升的趋势，均高于阴性对照，并显著高于阳性对照(P<0.05)。当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，根系活力最高，为120.73 μg/(g·h)，比阴性对照升高了47.45%，比阳性对照升高了68.31%。说明潞党参能增强蚕豆根尖细胞的根系活力。

表3 潞党参对蚕豆根系活力的影响 Tab.3 Effect of Codonopsis pilosula on root activity of Vicia faba

2.4 潞党参对蚕豆根尖SOD活性的影响

以不同质量浓度潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺处理的蚕豆根尖进行恢复培养，根尖SOD活性的变化见表4。由表4可知，随着潞党参质量浓度增加，SOD活性呈先上升后下降再上升的趋势，各处理与阳性对照相比均差异显著(P<0.05)。当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，SOD活性最高，为88.44 U/g，比阴性对照提高了17.29%，比阳性对照提高了24.37%。说明潞党参可提高蚕豆根尖的抗氧化活性，减缓衰老，抑制环磷酰胺对蚕豆根尖的损伤。

表4 潞党参对蚕豆根尖SOD活性的影响 Tab.4 Effect of Codonopsis pilosula on SOD activity of Vicia faba root tip

2.5 潞党参对蚕豆根尖MDA含量的影响

以不同质量浓度潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺处理的蚕豆根尖进行恢复培养，根尖MDA含量的变化见表5。由表5可知，随着潞党参质量浓度的增加，蚕豆根尖MDA含量整体呈先下降后上升的趋势。潞党参各质量浓度水提液处理根尖MDA含量均低于阴性对照和阳性对照，且差异显著(P<0.05)。当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，MDA含量最低，为13.75 nmol/g，比阴性对照降低了34.83%，比阳性对照降低了42.59%。说明潞党参对蚕豆根尖的损伤有一定的修复作用。

表5 潞党参对蚕豆根尖MDA含量的影响 Tab.5 Effect of Codonopsis pilosula on MDA content of Vicia faba root tip

3 结论与讨论

植物微核技术具有操作简单、快速、灵敏、经济等特点，试验结果可靠，具有较强的实用性[16]。本研究采用蚕豆根尖微核检测技术研究潞党参水提液对30 mg/L环磷酰胺诱导蚕豆根尖损伤的修复作用。微核试验结果表明，与阳性对照相比，不同质量浓度潞党参水提液可不同程度地降低微核率，显著抑制根尖细胞的遗传损伤。潞党参水提液质量浓度为0.10 g/mL和0.15 g/mL时可将30 mg/L环磷酰胺对蚕豆根尖的轻度污染降为基本没有污染，说明潞党参对环磷酰胺的损伤有显著的抗突变作用。

正常情况下，机体通过产生和清除自由基维持正常的生理功能，但是当环境因素发生改变时，会诱导机体的抗氧化机制，保持自由基的产生与消除的平衡，对机体预防疾病与抗衰老等具有重要意义。根系是植株生长发育的重要器官，其活力可反映植物根系整体的发育状况，是根系生命力综合评价的重要指标[17]。当加入不同质量浓度潞党参水溶液后，蚕豆根系活力和根系还原糖含量均高于阴性对照和阳性对照，说明潞党参可为根系生长提供能量，并促进其生长发育。当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，还原糖含量最高，根系活力最强。

抗氧化和抗衰老作用主要与机体清除自由基和抗脂质过氧化能力有关。SOD作为体内清除活性氧的主要抗氧化酶，被认为是反映体内自由基清除能力的间接评价指标[18]。而MDA是自由基作用于不饱和脂肪酸产生的脂质过氧化产物，通常作为机体脂质过氧化程度的指标[19]。本试验中，加入不同质量浓度潞党参水提液后，根系中SOD活性均高于阳性对照和阴性对照，MDA含量均显著低于阳性对照和阴性对照。这与党参多糖可提高小鼠体内SOD活性和降低MDA含量，实现抗氧化作用的结果相一致[20-21]。因此，不同质量浓度潞党参水提液对环磷酰胺诱导的蚕豆根尖损伤具有一定的修复作用。当潞党参质量浓度为0.05 g/mL时，SOD活性最高，MDA含量最低。

综上所述，不同质量浓度的潞党参水提液对环磷酰胺诱导的蚕豆根尖损伤均具有一定的抗突变作用，且潞党参水提液质量浓度为0.05 g/mL时，抗突变作用最好。有研究表明，活性化合物可以通过改变诱变剂对机体遗传物质的损伤而发挥抗突变作用[22]，因此，潞党参的抗突变作用可能与潞党参中的党参多糖可提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化作用有关，具体作用机制还需要在后续的试验中进行探讨。