微量元素对川芎活性成分的影响

陈媛媛，张 超，廖雪梅，沙秀芬,3，陶 珊，袁 灿，徐正君，彭 芳

(1.四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300； 2.四川农业大学 水稻研究所，四川 成都 611130； 3.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610101)

微量元素是植物正常生长所必需的营养元素[1-2]，其中，B参与细胞壁的形成，影响植株生殖生长及碳水化合物的合成、转运、代谢，进而影响作物的产量及品质[3-4]；Zn是多种蛋白质的重要组成部分，超过1 200种蛋白质含有Zn2+或与Zn2+结合、参与Zn2+转运[5-6]；Fe参与电子转移、氧化、还原反应，促进叶绿素合成，影响光合系统的量子产量，Fe-S蛋白、铁血红素蛋白是光合作用和呼吸作用的重要蛋白质[5,7]。前人研究表明，微量元素影响植株生长发育[8]及药材活性成分的积累，如菊花总黄酮及绿原酸含量随施Zn量增加而增加[9]，Mn、Zn、Mo可提高乌拉尔甘草根中甘草酸、甘草苷及总黄酮的含量[10]，Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、B能提高益母草总生物碱含量[11]，Fe、Zn、B、Mn能增加附子总生物碱含量[12]，Zn、B、Mo有利于川白芷欧前胡素和总香豆素含量的提高[13]，Zn、B可增加三七总皂苷产出量[14]，Zn、B、Mo可使瓦布贝母总生物碱含量达0.43%[15]。

川芎为我国传统大宗中药材，是伞形科藁本属植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥地下根茎，具有活血行气、祛风止痛[16]功效。川芎的活性成分主要是苯酞类、酚酸类及生物碱类，以苯酞类化合物含量最多，如藁苯内酯、洋川芎内酯等，具有舒张平滑肌、抑制平滑肌细胞异常增殖、调节心脑血管及神经系统的作用；绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯等酚酸类化合物具有抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集、抗血栓等功效[17-18]，临床常用于治疗冠心病、脑梗死、心绞痛、月经不调等[19]。

已有学者研究了配施大量元素氮磷钾肥[20]、不同氮素形态[21]、施氮时期和用量[22]对川芎阿魏酸、总生物碱含量的影响，但微量元素对川芎活性成分含量的影响研究尚未见文献报道。鉴于此，采用“3414”试验设计，通过盆栽试验探索B、Zn、Fe对川芎活性成分含量的影响，为川芎栽培中微量元素平衡施肥技术的形成奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试川芎为四川省彭州市栽培品种，经四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所胡尚钦研究员鉴定为藁本属植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)。B肥为硼砂(Na2B4O7·10H2O)、Zn肥为硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、Fe肥为硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，试剂均为分析纯。盆栽基质按细土 ∶ 珍珠岩 ∶ 沙子=3 ∶ 1 ∶ 1的比例混匀，每盆装基质17 kg。供试基质土壤理化性质：pH值7.09，有机质65.6 g/kg、全氮2.958 g/kg、有效磷164.7 mg/kg、速效钾590.0 mg/kg、有效硼0.88 mg/kg、有效锌7.38 mg/kg、有效铁48.6 mg/kg。

1.2 试验设计

在避雨大棚内进行盆栽试验，盆体42 cm×28 cm×28 cm(上径×下径×高)。选择大小均匀的苓种，2018年9月21日栽种，栽前每盆施0.5 kg油枯，与基质混匀。试验设置B、Zn、Fe 3个因素，各4个水平(0水平为不施肥；1水平为低质量浓度施肥；2水平为中等质量浓度施肥，施肥量为1水平的2倍；3水平为高质量浓度施肥，施肥量为2水平的2倍)，具体见表1。每个处理10盆，每盆8株，出苗后定植6株。11月21日、次年3月19日分别追施复合肥(N 18%、P2O516%、K2O 18%)5.6、2.4 g/盆。分别于11月6日、12月7日、次年3月19日及4月17日，按照表1各处理设置进行叶面喷施微肥，每次Zn、Fe混合配制溶液，喷施50 mL/盆，B单独配制溶液，喷施50 mL/盆。于2019年5月14日(收获期)取样，随机选取3盆，每盆随机取1株，混合作为1个重复样品；在剩下的盆里再随机选取3盆，每盆随机取1株，混合作为第2个重复样品；余下4盆每盆随机取1株，混合作为第3个重复样品。地下根茎用清水洗净，40 ℃烘干，粉碎过0.25 μm筛，密封保存，备用。

表1 B、Zn、Fe配施方案

1.3 测定指标及方法

采用岛津Nexera X2超高效液相色谱仪测定绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁苯内酯、洋川芎内酯A含量，参考陈雏等[23]的方法并稍作修改。色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C183 μm，流动相为0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)，柱温为30 ℃，进样体积为2 μL、流速为0.4 mL/min，洗脱程序：2 min，5% B；9.5 min，80% B；10 min，100% B；11 min，100% B；13 min，5% B；15 min，停止分析。供试液制备：取样品粉末0.5 g于具塞锥形瓶中，加入95 ∶ 5的甲醇-甲酸溶液50 mL，密塞，摇匀，称质量，210 W、40 kHz超声提取30 min，放冷，补足失质量，摇匀，静置，取上清液，过0.22 μm滤膜。对照品溶液制备：分别精密称取适量标准品(购自成都曼斯特生物科技有限公司)溶于95 ∶ 5的甲醇-甲酸溶液中，稀释配制成48 μg/mL绿原酸、3.1 μg/mL阿魏酸、10 μg/mL阿魏酸松柏酯、32 μg/mL洋川芎内酯A、160 μg/mL藁苯内酯对照品溶液。同时进行方法学考察。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2010及SPSS 22.0软件进行统计分析、作图。

2 结果与分析

2.1 川芎5种活性成分含量测定的方法学考察

2.1.1 线性关系 取对照品溶液，分别进样0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μL，以样品量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归拟合，结果如表2所示，各成分线性关系均较好。

表2 川芎5种活性成分的线性关系考察结果Tab.2 Investigation results of the linear relationship of 5 active ingredients of Ligusticum chuanxiong Hort.

2.1.2 精密度 取对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A峰面积的RSD值分别为2.12%、0.95%、1.08%、2.92%、0.56%，精密度较好。

2.1.3 重复性 取同一样品平行测定6份供试品溶液的5种活性成分含量，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量的RSD值分别为0.49%、1.50%、1.27%、1.66%、2.09%，重复性较高。

2.1.4 稳定性 取同一样品，提取后放置0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h进样分析，计算峰面积，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A峰面积的RSD值分别为0.65%、1.29%、0.91%、2.07%、2.18%，24 h内稳定性较好。

2.1.5 加标回收率 精密称取同一样品6份，每份0.25 g，分别加入相当于已知含量的对照品贮备液，按1.3方法提取测定，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A的加标回收率分别为99.60%、95.12%、98.65%、99.16%、104.37%，回收率较好。

2.2 B、Zn、Fe肥配施对川芎5种活性成分含量的影响

叶面喷施B、Zn、Fe肥对川芎绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯及洋川芎内酯A积累具有显著影响。如表3所示，B0Zn2Fe2、B1Zn2Fe2处理促进绿原酸积累，分别高于空白组(B0Zn0Fe0)3.83%、10.63%，其余处理均有抑制作用；B2Zn3Fe2、B1Zn1Fe2、B1Zn2Fe1处理促进阿魏酸积累，分别高于空白组23.00%、5.00%、4.00%，其余处理均有抑制作用；B0Zn2Fe2处理阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A含量积累，分别高于空白组6.46%、6.71%，其余处理均抑制二者积累；B、Zn、Fe施用均不利于藁本内酯积累。因此，叶面喷施B、Zn、Fe肥未必能有效促进川芎活性成分的积累，用量不当反而存在抑制作用。

表3 B、Zn、Fe肥配施对川芎5种活性成分含量的影响Tab.3 Effects of B,Zn,Fe fertilizers combined application application on 5 active ingredients content of Ligusticum chuanxiong Hort. mg/g

2.3 B、Zn、Fe肥单因素对川芎5种活性成分含量的影响

如表4所示，当Zn、Fe均为中等质量浓度(Zn2Fe2)时，施B不利于阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累，低质量浓度B(B1)有利于绿原酸及阿魏酸积累，分别比不施B增加6.56%、2.22%，B用量过高反而存在抑制作用。当B、Fe均为中等质量浓度(B2Fe2)时，施Zn不利于阿魏酸松柏酯积累，低质量浓度Zn(Zn1)对绿原酸、藁本内酯、洋川芎内酯A积累的影响与不施Zn无显著差异，用量过大有明显抑制作用；高质量浓度Zn(Zn3)促进阿魏酸积累，比不施Zn增加33.70%。当B、Zn均为中等质量浓度(B2Zn2)时，施Fe可促进5种活性成分积累，高质量浓度Fe(Fe3)水平下绿原酸、阿魏酸含量最高，分别高于不施Fe处理8.46%、6.98%；低质量浓度Fe(Fe1)处理，阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量最高，分别高于不施Fe处理5.34%、9.79%、12.23%。

表4 B、Zn、Fe肥对川芎5种活性成分含量的影响Tab.4 Effects of single factor of B,Zn,Fe fertilizers on the 5 active ingredients content of Ligusticum chuanxiong Hort. mg/g

2.4 B、Zn、Fe肥交互作用对川芎5种活性成分含量的影响

2.4.1 不同Zn、Fe水平的B肥效应 从图1可知，B用量从低质量浓度增加到中等质量浓度，当Fe为中等质量浓度时，低质量浓度Zn水平下，因B用量增加，绿原酸含量增加3.58%，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少16.19%、50.02%、28.77%、28.85%；中等质量浓度Zn水平下，因B用量增加，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少28.69%、13.04%、28.36%、17.41%、19.57%，说明B用量增加不利于川芎5种活性成分积累，但Zn用量增加可减弱因B用量增加产生的不利影响，故B、Zn存在负交互作用。

当Zn为中等质量浓度时，低质量浓度Fe水平下，因B用量增加，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少10.66%、18.27%、23.90%、8.71%、8.87%；中等质量浓度Fe水平下，因B用量增加，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少28.69%、13.04%、28.36%、17.41%、19.57%，说明Fe用量增加会加强因B用量增加对绿原酸、阿魏酸

图1 不同Zn、Fe水平的B肥效应

松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A产生的不利影响，减弱对阿魏酸积累的不利影响，故B、Fe对绿原酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸积累存在负交互作用。

2.4.2 不同B、Fe水平的Zn肥效应 如图2所示，当Fe为中等质量浓度时，低质量浓度B水平下，Zn用量从低质量浓度增加到中等质量浓度，绿原酸含量增加23.05%，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量因Zn用量增加分别减少11.43%、29.42%、17.88%、16.33%；中等质量浓度B水平下，绿原酸、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A含量因Zn用量增加分别减少15.26%、7.95%、4.79%、5.44%，阿魏酸松柏酯含量增加1.16%，说明Zn用量增加不利于川芎活性成分积累，但B用量增加会减弱因Zn用量增加产生的不利影响，即Zn、B存在负交互作用。

当B为中等质量浓度时，低质量浓度Fe水平下，因Zn用量增加，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯含量分别减少12.70%、14.14%、13.64%、0.81%，洋川芎内酯A含量,增加1.55%；中等质量浓度Fe水平下，因Zn用量增加，绿原酸、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少15.26%、7.95%、4.79%、5.44%，阿魏酸松柏酯含量增加1.16%，说明Fe用量增加使因Zn用量增加对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A产生的不利影响增大，对阿魏酸及阿魏酸松柏酯积累的不利影响减弱，故Zn、Fe对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸及阿魏酸松柏酯积累存在负交互作用。

图2 不同B、Fe水平的Zn肥效应

2.4.3 不同B、Zn水平的Fe肥效应 由图3可得，当Zn为中等质量浓度时，低质量浓度B水平下，Fe用量从低质量浓度增加到中等质量浓度，绿原酸含量增加15.68%，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量分别减少11.54%、34.61%、19.12%、18.11%；中等质量浓度B水平下，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量因Fe用量增加分别减少7.65%、4.71%、38.44%、26.83%、27.74%，说明Fe用量增加不利于川芎活性成分积累，且B用量增加可增强因Fe用量增加对绿原酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累的不利影响，减弱对阿魏酸积累的不利影响，故Fe、B对绿原酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸积累存在负交互作用。

当B为中等质量浓度时，低质量浓度Zn水平下，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量因Fe用量增加分别减少4.83%、11.11%、47.47%、22.53%、22.40%；中等质量浓度Zn水平下，绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A含量因Fe用量增加分别减少7.65%、4.71%、38.44%、26.83%、27.74%，说明Zn用量增加使因Fe用量增加对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A产生的不利影响增大，对阿魏酸及阿魏酸松柏酯积累的不利影响减弱，故Fe、Zn对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸及阿魏酸松柏酯积累存在负交互作用。

图3 不同B、Zn水平的Fe肥效应

3 结论与讨论

前人研究表明，叶面喷施微量元素有利于药材活性成分积累，改善药材品质，Zn、B有利于提高川白芷欧前胡素和总香豆素含量[13]，Zn(0.5、1.0、1.5 g/L)显著提高乌拉尔甘草根中甘草酸、甘草苷及总黄酮含量[10]，B促进益母草总生物碱积累，0.2% B处理生物碱总量为1.81%，0.4% B处理生物碱总量达2.09%[11]。本研究显示，施B、施Zn不利于川芎活性成分积累，其中B抑制阿魏酸松柏酯、藁本内酯及洋川芎内酯A积累，Zn抑制阿魏酸松柏酯积累，中、高质量浓度(2、4 g/L)Zn抑制绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A积累，低质量浓度Zn(1 g/L)则无显著影响，这可能是因为对川芎而言，本研究所施用的质量浓度过高，反而起抑制作用。说明不同药材对微量元素的需求量不同，应对每种药材实施针对性研究，川芎栽培中不能仅参考其他药材的养分管理方式进行施肥，需探索适宜川芎的精准施肥方案。而B的抑制效果强于Zn，这可能与川芎对B、Zn的耐受程度有关。陈兴福等[24]研究表明，川芎中B含量为0.64 mg/kg，Zn含量为9.20 mg/kg，说明川芎对B的吸收能力远低于Zn，故可能川芎对B更敏感；也可能是由于本试验土壤本身B含量较高(0.88 mg/kg)，再施B反而有不利影响。因此，需进一步研究低质量浓度B、Zn的作用效果，而由于B、Zn存在负交互作用，故后续还需研究其配施比例，探索适宜川芎的最佳用量及配比。

虽然B、Zn对川芎活性成分的积累有不利影响，但低质量浓度B(1 g/L)可促进绿原酸及阿魏酸积累，高质量浓度Zn(4 g/L)促进阿魏酸积累。低质量浓度Fe(1 g/L)促进阿魏酸松柏酯、藁本内酯及洋川芎内酯A积累，高质量浓度Fe(4 g/L)有利于绿原酸、阿魏酸积累。说明不同活性成分受B、Zn、Fe元素的影响不同。B、Fe对绿原酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸积累存在负交互作用；Zn、Fe对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A积累存在正交互作用，对阿魏酸及阿魏酸松柏酯积累存在负交互作用，各活性成分的具体响应机制有待进一步研究，可根据不同需求研制有利于提高某一种或几种成分含量或药材整体品质的专用配方。

微量元素施用促进植株营养生长，有利于提高作物产量，如Zn、Fe配施可提高冬小麦成穗数、穗粒数，增产19.6%[25]，Si、Zn、B配施可使早、晚稻产量分别增加12.6%、10.6%[26]。但药材活性成分主要是植物新陈代谢的次生代谢产物，是植物体内各种生理活动协调进行的结果[27]，提供全面、充分的营养有利于植株营养生长，但未必有利于植株的次生代谢。韩蕊莲等[28]研究指出，在一定范围内Cu、Mg、Zn、B肥可促进三七产量增加，但4种微肥均不利于三七有效成分总量增加。因此，川芎栽培中需综合考虑药材的产量及品质，探究最佳的施肥方式。

综上所述，叶面喷施B肥不利于川芎阿魏酸松柏酯、藁本内酯及洋川芎内酯A积累，Zn肥不利于阿魏酸松柏酯积累，适量Fe肥可促进川芎活性成分积累。B、Zn对5种成分积累均有负交互作用，B、Fe对绿原酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、洋川芎内酯A积累有正交互作用，对阿魏酸积累有负交互作用；Zn、Fe对绿原酸、藁本内酯及洋川芎内酯A积累有正交互作用，对阿魏酸、阿魏酸松柏酯积累有负交互作用。因此，叶面喷施B、Zn、Fe肥未必能有效促进川芎活性成分的积累，用量不当反而有负面影响，栽培中应适当少施或不施。