RAPD、ISSR分子标记联合鉴定毛木耳菌株的研究

黄艺宁

(漳州职业技术学院，福建 漳州 363000)

毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)属木耳目(Auriculariales)木耳科(Auriculariaceae)木耳属(Auricularia)[1-3]，其质地脆滑，清新爽口，食药兼用，素有“树上海蜇皮”之美称，是热带和亚热带地区主要食用菌之一[4-5]。

长期以来，毛木耳栽培品种以43系列为主，品种比较单一，已满足不了多元化的市场需求。此外，经过多年的使用，栽培品种已出现不同程度的老化退化现象，产量、质量均下降，导致毛木耳市场价格低迷，严重影响耳农种植的积极性，制约毛木耳产业的发展。因此，选育新品种是毛木耳产业发展的关键环节。毛木耳新品种的选育是以现有栽培菌株为基础的，然而目前毛木耳栽培菌株混杂，不利于杂交育种工作的开展，迫切需要对引进的毛木耳菌株进行鉴定分类。传统的食用菌鉴定方法主要是利用子实体的形态特征，需要出菇进行鉴定，不仅鉴定周期长，而且容易受到环境的影响。随着分子生物学的发展，分子标记已经广泛应用在食用菌种质资源鉴定评价方面。秦莲花等[6]将ITS(内转录间隔区)与ISSR(简单重复序列间扩增)技术结合，作为香菇生产菌株鉴别的方法。张介驰等[7]采用ISSR鉴别27个东北地区黑木耳生产菌株。王守现等[8]采用酯酶同工酶聚类分析的方法，将6个灰树花菌株分为三大类，RAPD(随机扩增多态性)和ISSR共同验证结果与酯酶同工酶分析结果一致。杨军等[9]采用ISSR和RAPD对供试的40株灰树花菌株进行鉴定，发现利用2种分子标记比单独使用1种分子标记鉴定的结果更准确，菌株类别划分更精细。在毛木耳种质资源鉴定评价方面，张丹等[10]利用ISSR标记将55个供试毛木耳菌株分为5大类群，张丹等[11]利用22个RAPD引物对56个不同的木耳菌株进行分析鉴定，杜萍等[12]建立和优化了野生毛木耳ISSR-PCR的反应体系。但结合ISSR和RAPD对毛木耳菌株进行鉴定和遗传多样性分析的研究却鲜见报道。鉴于此，采用RAPD、ISSR 2种分子标记对10个不同来源的毛木耳菌株进行鉴定，研究其遗传多样性和亲缘关系，为今后毛木耳杂交育种亲本的选配及种质资源的有效利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的10个毛木耳菌株具体信息见表1。

1.2 生化试剂

Taq酶、dNTPs、10×Buffer缓冲液、Mg2+等均购自TaKaRa公司(大连)；RAPD随机引物、ISSR引物为Sangon产品。

表1 供试毛木耳菌株及其来源Tab.1 Tested strains of Auricularia cornea Ehrenb and their sources

1.3 试验方法

1.3.1 供试菌株DNA提取 采用改良的CTAB法[13]提取DNA。

1.3.2 RAPD、ISSR多态性分析

1.3.2.1 PCR反应扩增体系 PCR反应扩增体系具体见表2，其中RAPD、ISSR反应体系的DNA模板使用量均为10 ng。

表2 PCR反应扩增体系Tab.2 PCR reaction system μL

1.3.2.2 PCR扩增条件及电泳 RAPD及ISSR反应程序参考文献[14-15]。RAPD-PCR反应程序:起始94 ℃预变性7 min，94 ℃变性1 min，34 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环数35个，最后延伸72 ℃10 min。ISSR-PCR反应程序:起始94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，44～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 循环数35个，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物检测：取扩增产物7 μL，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/mL GoldViewTM DNA 染料)，160 V恒压1.5 h，通过紫外凝胶成像系统观察并照像。

1.4 数据处理

统计DNA条带，构建“0-1”矩阵表，输入Excel软件，利用公式计算多态性比率(P)[16]，P=k/n×100%，式中：k为多态性位点数，n为位点总数。

利用DPS统计软件，采用Jaccard聚类距离中的类平均法(UPGMA)进行聚类分析，并形成供试菌株的遗传聚类图。

1.5 综合RAPD、ISSR聚类分析

综合RAPD和ISSR扩增条带的统计数据进行相似系数计算和UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 毛木耳菌株的RAPD分析结果

2.1.1 多态性分析结果 利用3个RAPD引物对供试菌株进行PCR扩增(图1—3、表3)。扩增条带大小分布在0.30～2.50 kb。每个引物扩增的条带数有差异，为8～11条，每个引物平均扩增9.3条条带，共获得28个扩增条带，多态性比率为100%。说明这3个RAPD引物扩增毛木耳多态性强、稳定，供试菌株多态性丰富。

2.1.2 聚类分析结果 由图4可以看出，供试菌株间相异距离为0.25～0.89，遗传多样性较丰富。在相异距离为0.60时，所有供试菌株被分为5个群体，包括2个复合群体和3个单一群体。菌株781、大光、白背毛木耳、黄背木耳、台耳134为一个群体；43、43-28为另一个群体；99丰、43-1、川毛10号为3个单独群体。其中，43、43-28相异距离为0.34，说明这2个菌株遗传距离较近。川毛10号与2个复合群体的相异距离为0.80。99丰、43-1与其他菌株相异距离为0.89，说明这2个菌株与其他菌株的遗传距离远，亲缘关系远。在供试菌株中遗传距离最近的为白背毛木耳、黄背木耳，相异距离为0.25。

图1 引物S33对10个毛木耳菌株扩增的RAPD分子标记图谱Fig.1 Amplification RAPD map of primer S33 for 10 tested strains

图2 引物S1508对10个毛木耳菌株扩增的RAPD分子标记图谱Fig.2 Amplification RAPD map of primer S1508 for 10 tested strains

图3 引物S2058对10个毛木耳菌株扩增的RAPD分子标记图谱Fig.3 Amplification RAPD map of primer S2058 for 10 tested strains

表3 RAPD标记所用的PCR引物序列及扩增结果Tab.3 PCR primer sequences and amplification results used in RAPD

2.2 毛木耳菌株的ISSR分析结果

2.2.1 多态性分析结果 利用4个ISSR引物对供试菌株进行PCR扩增(图5、表4)。扩增条带大小分布在0.25～1.90 kb。每个引物扩增的条带数量有差异，为7～9条，平均扩增8条条带。共获得32条扩增条带，其中，多态性条带为30条，多态性比率为93.75%，每个引物平均扩增7.5条多态性条带。说明这4个ISSR引物扩增毛木耳多态性强、稳定，供试菌株多态性丰富。

2.2.2 聚类分析结果 由图6可以看出，供试菌株间相异距离为0.10～0.85。在相异距离为0.60时，所有供试菌株被分为4个群体，包括1个复合群体和3个单一群体。99丰、川毛10号、43为3个单独群体，其他菌株聚为一类。99丰与其他菌株的相异距离为0.85，说明99丰遗传距离最远。在相异距离为0.15时，菌株781、黄背木耳、白背毛木耳聚为一类，说明这3个菌株的遗传距离较近。

图4 10个毛木耳菌株基于RAPD的遗传聚类结果Fig.4 Genetic clustering map of 10 test strains based on RAPD

图5 引物ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、ISSR18(d)对10个毛木耳菌株扩增的ISSR分子标记图谱Fig.5 Amplification ISSR map of primer ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、 ISSR18(d) for 10 tested strains

表4 ISSR标记所用引物序列及扩增结果Tab.4 PCR primer sequences and amplification results used by ISSR

2.3 综合RAPD、ISSR的聚类分析结果

由图7可以看出，供试菌株间相异距离在0.13～0.87，遗传多样性较丰富。在相异距离为0.60时，所有供试菌株被分为5个群体，包括2个复合群体和3个单一群体。菌株43、43-28为一个群体，相异距离为0.48，说明这2个菌株遗传距离较近。大光、白背毛木耳、781、黄背木耳、台耳134这5个菌株为另一大的群体，相异距离为0.40，遗传距离较近。川毛10号、99丰、43-1为3个单独群体。99丰、川毛10号、43-1与其他菌株的相异距离分别为0.87、0.77、0.70，遗传距离较远。在综合聚类分析时，在相异距离为0.87时，99丰与43-1聚在一起，而利用RAPD单独分析时，在相异距离为0.80时，99丰与43-1聚为一类。

图6 10个毛木耳菌株基于ISSR的遗传聚类结果Fig.6 Genetic clustering results of 10 test strains based on ISSR

图7 供试菌株基于RAPD、ISSR的遗传聚类结果Fig.7 Genetic clustering results of test strain based on RAPD and ISSR

3 结论与讨论

种质资源是品种选育的物质基础[17]。种质资源的遗传多样性研究是评价种质资源的主要手段，可以为种质资源的有效、合理利用提供重要的遗传信息。传统的食用菌鉴定方法鉴定周期长且容易受到环境的影响。目前,分子标记已经广泛应用于食用菌种质资源的鉴定评价。近几年来，基于PCR的分子标记技术如RAPD、ISSR、序列相关扩增多态性(SRAP)等被应用于食用菌的品种鉴定、亲缘关系和遗传多样性、进化关系等方面的研究[18-23]。RAPD分子标记技术原理是对基因组DNA进行随机扩增，操作简单，而且可以检测整个基因组，检测效率高[24]，具有通用性[25]，多态性好，但存在重复性差等问题。ISSR是基于SSR发展的分子标记技术，不同材料的SSR数目、间隔长短不同，使得特定结合位点相应变化[26]，因此，可以分析不同样品的多态性。ISSR更加稳定、可靠，试验重复性好，可以较好地克服RAPD的缺点[27]。由于每种分子标记扩增的基因组DNA位置不同，利用多种分子标记相结合进行遗传分类、多样性分析，比单独使用一种分子标记分析的结果更准确[28]。

本研究引进湖南、四川、贵州、湖北、江苏、福建等地的毛木耳菌株。采用RAPD、ISSR 2种分子标记技术对供试菌株进行遗传多样性分析，结果表明，供试菌株多态性较为丰富，RAPD、ISSR分子标记的多态性比率分别为100%、93.75%。说明RAPD、ISSR可以检测到供试菌株丰富的遗传多态性，能够对供试菌株进行有效的区分。

供试菌株间相异距离为0.13～0.87，遗传多样性较丰富。在相异距离为0.60时，基于RAPD分子标记的聚类分析，供试菌株被分为5个群体，菌株781、大光、白背毛木耳、黄背木耳、台耳134为一个群体；43、43-28为另一个群体；99丰、43-1、川毛10号为3个单独群体。基于ISSR分子标记的聚类分析，所有供试菌株被分为4个群体，99丰、川毛10号、43为3个单独群体，其他菌株聚为一类。基于不同的分子标记，供试菌株聚类有相似的地方。如基于RAPD的聚类分析，菌株白背毛木耳与黄背木耳相异距离为0.25。基于ISSR的聚类分析，菌株白背毛木耳与黄背木耳相异距离为0.15。RAPD、ISSR分子标记相互印证说明这2个菌株遗传距离比较近，遗传背景较一致。试验也发现基于不同分子标记的聚类分析有一定的差异。如基于RAPD的聚类分析，43-1为单独一类，与其他菌株的遗传距离远，相异距离为0.80，说明43-1与其他菌株亲缘关系远。而基于ISSR的聚类分析，在相异距离为0.50时，43-1与大光、白背毛木耳、781、黄背木耳、台耳134这5个菌株聚在一起，说明43-1与这5个菌株遗传距离较近。再比如，基于RAPD的聚类分析，菌株43与43-28的相异距离为0.34，说明这2个菌株遗传距离较近。而基于ISSR的聚类分析，菌株43与43-28的相异距离为0.68，说明这2个菌株遗传距离比较远。表明这2种分子标记各自的分析结果有一定的差异，所以单独使用一种分子标记进行遗传多样性分析有一定的局限性，这与江玉姬等[28]的结论一致。综合RAPD、ISSR 2种分子标记的多态性位点进行聚类分析，所有供试菌株被分为5个群体，菌株43、43-28为一个群体，菌株43、43-28的相异距离为0.48，说明2个菌株的遗传距离较近。结合这2个菌株的来源分析，43-28是从43选育而来的，两者具有较相似的遗传背景，遗传距离近。这也印证了综合RAPD、ISSR进行遗传分析较为准确。毛木耳包括黄背毛木耳、白背毛木耳两大栽培种类。由于43-28为漳州主栽白背毛木耳品种，43为老的白背毛木耳品种，分析这个群体为白背毛木耳种类。大光、白背毛木耳、781、黄背木耳、台耳134这5个菌株为另一大的群体，菌株781为漳州90年代的主栽种，是黄背毛木耳品种。大光、黄背木耳分别来源于福建省三明真菌研究所、四川省农业科学院，均是黄背毛木耳种类，因此推测这个大类群为黄背毛木耳种类，但在这个类群中，出现来自华中农业大学的白背毛木耳，这个菌株与黄背木耳的相异距离为0.25，2个菌株遗传距离较近，遗传背景相似。理论上这个菌株也是属于黄背毛木耳的范畴。但从菌株名称来看，白背毛木耳属于白背毛木耳种类的范畴。推测白背毛木耳菌株为名称混淆，结果有待于进一步验证。99丰、川毛10号、43-1为3个单独群体。99丰、川毛10号、43-1与其他菌株的相异距离分别为0.87、0.77、0.70，遗传距离远，亲缘关系远。根据本试验结果，3个单一群体、2个复合群体之间的菌株遗传距离较远，可作为育种亲本的备选菌株。本研究主要从分子水平上对供试菌株进行鉴定，今后的试验可再结合菌株菌丝、子实体形态特征及其生理生化特征，实现毛木耳菌株更加全面、准确的鉴定分析，为其育种提供性状互补、遗传距离远的优良亲本。