利用选择性清除方法鉴定牛繁殖性状相关的候选基因

吕世杰，陈付英，张子敬，王李辉，张松山，王二耀，徐照学，施巧婷

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002； 2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002； 3.平顶山市动物疫病预防控制中心，河南 平顶山 467000； 4.平顶山市畜产品质量安全监测中心，河南 平顶山 467000)

牛繁殖性状是重要的经济性状，对奶牛和肉牛产业发展具有重要意义。繁殖性能好的母牛表现为适时发情和易受孕，能够节约饲养成本，提高生产效率。繁殖性能的优劣不仅关系到牛群的数量，而且关系到整个牛群的经济效益。

现代奶牛生产中，随着对产奶性状的高强度选择，奶牛的繁殖性状呈现衰退趋势[1]，因繁殖性能差而被淘汰的奶牛数量增加[2]。改良奶牛繁殖性能成为育种工作者重要的研究内容，也被认为是奶牛未来选育的重要方向[3-4]。繁殖性状是复杂的数量性状，受到多个基因的控制，大多数繁殖性状遗传力的估计值较低(约为5%)[5]。在奶牛基因组选择时,增加选择指数中繁殖性状的比例能够减缓繁殖性能的衰退趋势，说明繁殖性状仍可通过选种选育进行提升[4]。因此，研究人员一直在进行繁殖性状的QTL定位，并希望能够将QTL信息加入到基因组选择的模型中以提高选种的准确性。目前，依据动物QTL数据库(Animal QTLdb)[6]，通过关联分析共发现17 867个QTLs与繁殖性状有关，但是主效基因仍不明确。

选择性清除是指在自然选择或人工选择过程中，群体内某些优势等位基因的频率增加，其周围与之连锁的染色体区域因搭车效应而出现多态性下降的一种现象。利用全基因组分析获得不同牛品种全基因组水平的选择性清除及品种间差异的基因组区域，并借此鉴定牛重要经济性状相关候选基因已成为可能[7-8]。利用选择性清除方法，通过对比高低繁殖力品种间的基因组差异，可进行牛繁殖性状候选基因鉴定，或对关联分析结果进行有益补充。

郏县红牛作为我国优良的地方黄牛品种，具备适应性强和繁殖力高等特点[9-10]，可考虑用来作为奶牛的比较群体进行牛繁殖性状候选基因鉴定。利用简化基因组测序(Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)技术对中国荷斯坦奶牛和郏县红牛进行全基因组SNP检测与分型，通过比较2个品种间差异的基因组区域，鉴定牛繁殖性状相关的候选基因组区域及候选基因，以期为牛繁殖性状相关的主效基因鉴定提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选择97头郏县红牛母牛(J)和32头中国荷斯坦奶牛母牛(D)为试验对象。郏县红牛来源于河南省平顶山市郏县红牛良种繁育中心，中国荷斯坦奶牛来源于河南省郑州市周边2个奶牛场。

1.2 DNA提取

通过尾静脉采集每头供试牛血样。使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒(Qiagen 公司,德国)提取血液总DNA。检测DNA质量和完整性，样品纯度要求A260/A280介于1.8～2.0。

1.3 SLAF-seq

通过SLAF-seq对试验个体进行测序以获得全基因组SNP标记[11]。以牛基因组(UMD 3.1)作为参考序列进行测序及分析，筛选保留位于常染色体上最小等位基因频率(Minor allele frequency)大于0.05和检出率(Call rates)大于0.8的SNP位点[12]。

1.4 选择性清除分析

在每条染色体上使用100 kb的滑动窗口及10 kb的步长检测选择性清除区域。采用R语言(3.4.1)的PopGenome软件包计算各滑动窗口内SNP位点的遗传分化系数(Fst)值和核苷酸多态性(π ratio)值，判断该滑动窗口是否受到选择。将Fst值和π ratio值(π奶牛/π郏县红牛)的99%分位数对应的值分别作为阈值，筛选2个品种间差异的基因组区域，然后对所得区域取交集。将重叠的滑动窗口合并为1段基因组区域。

1.5 候选基因筛选

将通过选择性清除方法筛选得到的基因组区域与Animal QTLdb(release 38)中牛QTLs进行比对，与繁殖性状QTL重合的区域作为候选基因组区域。利用R语言进行数据分析，通过biomaRt软件包的筛选功能获得候选基因组区域内的基因(参考基因组为UMD 3.1)。在Animal Omics数据库中查看候选基因在母牛繁殖相关组织间的表达情况(http://animal.nwsuaf.edu.cn)。该数据库中，与母牛繁殖相关的组织样本有卵巢(Ovary)、输卵管壶腹部(Ampula)和黄体(Corpus luteum)。根据区域内基因在这3种组织中的表达情况绘制基因表达情况图并进行聚类分析(https://software.broadinstitute.org/morpheus)。以FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值表示基因表达情况，根据基因表达量之间的Spearman相关系数进行聚类。如果FPKM>1，认为基因在该组织中表达，FPKM>10则为高表达[13]。

2 结果与分析

2.1 SNP标记开发与筛选

对牛基因组进行电子酶切预测后确定使用RsaⅠ和HaeⅢ进行酶切，酶切片段长度在414～444 bp的序列定义为SLAF标签。本试验共开发232 030个SLAF标签，平均测序深度为6.1×，经筛选后共得到30 233个SNP。

2.2 利用选择性清除方法分析2个牛品种间差异的基因组区域

Fst值和π ratio值的99%分位数分别为0.39和1.49。因此，选取Fst值大于0.39且π ratio值大于1.49的基因组区域为2个牛品种间差异的基因组区域。经过筛选，共得到了42个基因组区域和100个区域内基因。将得到的基因组区域与Animal QTLdb(release 38)的牛QTL数据库对比后，发现与291个已知QTL重合。在这42个候选区域内共有11个基因组区域与26个繁殖性状QTL重合(图1、表1)。

蓝色点是以Fst值和π ratio值均大于99%分位数筛选得到的区域Blue dots mean the regions with Fst and π ratio values which were greater than 99th percentile of genome-wide values图1 郏县红牛和中国荷斯坦奶牛品种间差异的基因组区域Fig.1 Diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle

2.3 利用基因表达量筛选候选基因区域内基因

与繁殖性状QTL重合的11个基因组区域共包含20个基因，其中14个基因功能已注释，且在Animal Omics数据库中有组织表达数据。依据FPKM>1筛选，共有9个基因在卵巢、输卵管壶腹部或黄体中表达(图2)。其中，有8个基因在卵巢中表达，7个基因在输卵管壶腹部中表达，5个基因在黄体中表达。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在各组织中均高表达(FPKM>10)。CFDP2与FAM204A基因聚为一类，表明二者具有相似的表达模式。

表1 郏县红牛和中国荷斯坦奶牛品种间与繁殖性状相关QTL重合的高差异基因组区域Tab.1 Highly diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle which overlap with QTLs of reproductive traits

标示的数字为FPKM值 The labeled number means the FPKM value图2 候选基因组区域内基因在母牛繁殖相关组织中的表达情况Fig.2 Expression statues of genes within the candidate regions in tissues related to cattle reproduction

3 结论与讨论

本研究利用SLAF-seq技术对郏县红牛(母牛)和中国荷斯坦奶牛(母牛)进行了全基因组SNP的开发，利用选择性清除方法筛选了2个品种间差异的基因组区域(Fst>0.39,π ratio>1.49)。共筛选得到42个基因组区域和100个区域内基因，其中11个基因组区域与26个繁殖性状QTL重合。在这11个基因组区域中，共有9个基因在母牛繁殖相关组织中表达。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在繁殖相关各组织中均高表达，可考虑优先作为牛繁殖性状相关候选基因。

CFDP1和CFDP2基因位于牛18号染色体。前人研究发现，18号染色体含有1个影响牛繁殖性能的关键QTL(44～62 Mb)，与怀孕率、产犊能力等性状有关[4,14]。CFDP1基因编码颅面发育蛋白1，与脊椎动物的颅面发育和成骨细胞生成有关[15-16]，并可能在胚胎发育过程中发挥作用[17]。在人类医学研究中，颅面发育异常的研究意义非凡，因为颅面发育异常往往会造成婴儿残疾或者死亡[18]。CFDP1基因在颅面发育中的重要作用提示其在生物体发育过程中扮演重要角色。该基因在动物繁殖过程中同样发挥作用，在小鼠胚胎中，通过原位杂交，发现该基因在胚胎发育早期(E8)广泛表达，并可能参与脑、心脏、肺脏等多种组织的发育[19]。在小鼠子宫胚胎着床点，CFDP1基因表达量相较于非着床点显著上调，表明该基因可能对胚胎子宫内着床起到调控作用[20]。根据Animal Omics Database中的基因表达数据，发现CFDP1基因在母牛繁殖相关组织中高度表达，并在卵巢中表达最高，也表明了该基因在动物繁殖过程中可能发挥的重要作用。根据选择性清除分析结果，CFDP1基因位于2个品种间高度差异的基因组区域(18号染色体:2 720 001～2 840 000 bp)，并处在怀孕率、第1次配种受胎率和产犊指数等性状相关的QTL区域内。可见，CFDP1基因可能与动物繁殖性能相关，可优先考虑为牛繁殖性状相关候选基因。CFDP2为反刍动物所特有，是CFDP1的重复基因，比CFDP1基因多插入了1个转座子Bov B-LINE，二者都属于祖先基因Bucentaur(BCNT)的重复基因[21]。CFDP2基因最早在牛大脑组织中发现[22]，但是其生物学功能还不明晰。根据CFDP2基因的表达情况和位置信息，认为CFDP2基因可能也参与牛繁殖调控，这是对该基因生物学功能的有益补充。此外，BCNT2也为BCNT家族的基因，在本试验中的3种繁殖相关组织中有表达，提示 BCNT基因家族可能参与牛的繁殖调控。BCNT家族大约在20 a前在牛中发现，其在发育过程扮演重要角色，并可能影响染色质结构[23]。上述基因或BCNT基因家族是否确参与牛繁殖调控仍需进一步验证。FAM204A基因位于牛26号染色体，具体生物学功能尚不清楚，与CFDP2基因表达模式类似，其可能也参与繁殖调控。有研究指出，鸡FAM204A基因与第1次产蛋年龄相关[24]，提示该基因具有作为繁殖性状候选基因的可能性。总体而言，根据本试验研究结果，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可优先考虑为牛繁殖性状相关的候选基因，但是由于繁殖性状的复杂性和基因功能研究的片面性，不能排除其他候选区域内基因为主效基因的可能性。

中国荷斯坦奶牛是19世纪末期由中国的黄牛与当时引进我国的荷斯坦牛杂交的品种，郏县红牛为中国地方黄牛品种，二者在遗传背景上差异较大。在进行基因组对比中，遗传背景的较大差异会增加结果的复杂性和假阳性。本试验筛选得到的42个基因组区域，不仅与繁殖性状有关，还与产奶、生长、抗病等多种性状有关。通过与繁殖性状QTL比对筛选了11个基因组区域，这些区域是否确与繁殖性状有关，有待通过对候选基因的验证以进一步证实。

综上，本研究通过比较郏县红牛和中国荷斯坦奶牛2个品种间差异的基因组区域，获得了11个与繁殖性状相关的基因组区域，包含9个在卵巢、输卵管壶腹部或黄体中表达的基因。其中，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可优先作为牛繁殖性状相关候选基因进行进一步验证研究。