血散薯块根内生真菌Periconia igniaria Stdif10发酵产物的生物活性研究

林 伟,骆海玉,邓业成,邓志勇,颜桢灵,张 泽,王瑞昊,汤夏安,冯蓓蓓

(珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西珍稀濒危动物生态学重点实验室/广西师范大学 生命科学学院,广西 桂林 541006)

血散薯学名黔桂千金藤(StephaniadielsianaY.C.Wu),又名金不换、一滴血,为防己科千金藤属药用植物[1]。块根是血散薯主要药用部位,具有多种药理作用,如用于上呼吸道感染、咽炎、疮痈、胃痛、胃肠炎、牙痛、神经痛、跌打损伤等的治疗[2],并对多种植物病原真菌具有良好的抑制作用[3-4]。血散薯常生于林中、山谷或溪边多石砾的地方,主要分布于两广、贵州南部和湖南南部等地,分布范围窄,资源有限。

植物内生真菌在植物中普遍存在,是指生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织内、对宿主植物组织并不引起明显病害症状的真菌[5]。植物内生真菌可以促进宿主植物营养吸收、提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力、刺激植物产生活性物质等,并且在与宿主植物长期协同进化过程中,可产生结构类型丰富、活性显著的代谢产物[6]。植物内生真菌已成为寻找具有农药活性次生代谢产物的重要资源[7],是植物病虫害生物防治领域的重要研究内容之一[8],也是当前天然产物开发研究的热点。

基于共生理论,血散薯内生真菌可能具有多种生物活性功能,笔者所在实验室(广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室)首次对血散薯内生真菌抗菌[9]、抗虫活性进行研究,以期为血散薯植物资源的保护以及其内生真菌的合理开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试内生真菌 供试内生真菌为PericoniaigniariaStdif10,由广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室前期从血散薯块根中分离和鉴定,GenBank序列号为MF159371。

1.1.2 供试玉米象 供试玉米象为Sitophiluszeamais由本实验室提供,将其置于培养罐中,在温度28 ℃、相对湿度75%条件下,以小麦粒饲养。待新一代成虫大量出现后14～21 d,筛选成虫供试验用[10]。

1.1.3 供试植物病原真菌 供试植物病原真菌为辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsica)、水稻胡麻叶病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘蓝黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、贡柑链格孢菌(Alternariacitri),其中,金橘砂皮病菌和贡柑链格孢菌由广西特色作物研究所提供,其余由广西大学农学院植物病理室提供。

1.1.4 供试动物病原细菌 供试动物病原细菌为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci),所有动物病原细菌均由桂林医学院微生物实验室提供。

1.1.5 培养基 培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基。

1.1.6 试剂 石油醚、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等试剂均为国产分析纯。

1.1.7 仪器 YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、SHA-B水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、VS-840-1型洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、RE52-2旋转蒸发仪(上海沪西分析仪器厂)ZHJH-C1112C型洁净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)、微量移液枪(日本Nichiryo公司)、LRH-250-G光照培养箱(广东省医疗器械厂)、CE2069A型电磁炉(深圳艾美特有限公司)、Sartorius电子天平(北京赛多利斯系统有限公司)等。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌发酵 采用经典大米固体发酵法,先将菌种从保种管里接种至PDA培养基活化,将活化3 d后的菌株用灭菌后的打孔器打取菌饼(直径0.4 cm)置于装有150 mL PDB的锥形瓶中,放入恒温振荡培养箱中,于28 ℃、160 r/min振荡培养7 d。将发酵液加至已灭菌的大米培养基中置于28 ℃恒温培养箱培养2个月,待用。

1.2.2 内生真菌发酵产物初步分离 采用有机溶剂液-液萃取法对上一步的发酵产物进行初步分离,分别以等量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取,得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

1.2.3 触杀活性测定 参考鞠克升[11]、姜洪等[12]、余海涛等[13]的滤纸药膜法,测定以上3种萃取物对玉米象的触杀活性。具体操作：用丙酮作为溶剂,分别将3种萃取物配制成1.573、2.360、3.145、4.718、6.290、7.863 mg/cm2浓度梯度的药液,在直径为9 cm的培养皿底放入同样直径的圆形滤纸,在滤纸上滴入相应浓度药液1 mL,在同直径的另一滤纸上滴加等量纯丙酮作为空白对照(CK)。皿壁上涂一层聚四氟乙烯浓缩分散液防止玉米象爬出,每皿放30头玉米象,每个处理3个重复,于72 h后观察结果,以拨针触及成虫尾部,触角及足不动者为死亡。通过SPSS软件统计死亡率,再按照武怀恒等[14]的方法计算得到毒力回归方程。

1.2.4 驱避活性测定 参考张海燕等[15]的滤纸药膜法,用丙酮将2种萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)分别配制成3.932、7.863、15.726 mg/cm2浓度梯度的药液,将直径为9 cm的圆形滤纸裁成两半,一半滤纸滴加相应浓度药液作为处理组,另一半滤纸滴加等量纯丙酮作为对照组,以上滤纸置于室温下,待丙酮挥发后,将两半滤纸重新并接,用黏胶纸固定后置于同一培养皿内,皿壁上涂一层聚四氟乙烯浓缩分散液防止玉米象爬出。每皿放30头玉米象,每个处理3个重复,分别于24、48、72、96 h观察结果[16],并按如下公式计算驱避率：驱避率=(对照组试虫数-处理组试虫数)/对照组试虫数×100%。

1.2.5 抗真菌活性测定 参考DENG等[3]的菌丝生长速率法,测定2种萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)对9种植物病原真菌的抗菌活性。将相应菌种接种至PDA中,27 ℃恒温培养72 h,进行活化。将萃取物先用丙酮配制成0.000 1、0.001 0、0.010 0、0.100 0、1.000 0、10.000 0 mg/mL的质量浓度梯度,在超净工作台中将1 mL药液与9 mL热熔PDA混合均匀,倒入直径为9 cm的培养皿中制成带药培养基。在已活化的供试菌边缘用无菌打孔器打出菌饼(直径0.4 cm),接种至带药培养基中(菌丝面朝下),每个培养皿接3个菌饼(甘蔗凤梨病菌每皿接1个),每个处理3个重复。对照组用等量丙酮代替药液,置于27 ℃光照培养箱中培养72 h后,用十字交叉法测量菌落直径,通过SPSS 10.0软件统计抑制率,再按照1.2.3的方法计算得到毒力回归方程。

1.2.6 抗细菌活性测定 参考慕立义[17]的带药培养基涂布法,测定2种萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物)对10种动物病原细菌的抗菌活性。将相应菌种接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37 ℃水浴恒温振荡器培养12 h活化。将发酵产物用丙酮配制成0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00、1.000 00 mg/mL的质量浓度梯度,取1 mL药液与9 mL热熔牛肉膏蛋白胨琼脂培养基混合均匀,倒入直径为9 cm的培养皿中制成带药培养基。取0.1 mL已活化的菌悬液与9.9 mL无菌水混合均匀,吸取0.1 mL加到带药培养基上,用涂布棒涂布均匀,制成带药培养平板,每个处理3个重复。阳性对照组CK用等量50 μg/mL氯霉素代替药液,阴性对照组CK用等量无菌水代替药液,其他条件不变,37 ℃条件下培养24 h后,观察结果,以不长菌的最低质量浓度为该药液对动物病原细菌的最低抑制质量浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对玉米象的触杀活性

采用滤纸药膜法测定了内生真菌P.igniariaStdif10发酵产物的3种不同溶剂萃取物对玉米象的触杀活性,结果如表1所示。石油醚萃取物对玉米象的触杀活性最好,LC50值为2.295 1 mg/cm2；其次为乙酸乙酯萃取物,LC50值为2.582 6 mg/cm2；正丁醇萃取物效果较差,对玉米象基本无影响。上述结果说明活性物质集中在石油醚层,属于低极性物质。

表1 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对玉米象的触杀活性Tab.1 Contact toxicity of different solvent extracts of endophytic fungus P.igniaria Stdif10 on S.zeamais

注：“—”表示无活性。正丁醇萃取物对玉米象无触杀活性,故未计算其毒力回归方程及LC50值。

Note：“—”Means inactive.Because n-butanol extract had no contact toxicity toSitophiluszeamais,the toxicity regression equation and median lethal concentration were not calculated.

2.2 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对玉米象的驱避活性

基于以上触杀活性结果,进一步测定了石油醚层和乙酸乙酯层萃取物对玉米象的驱避活性,结果如表2。石油醚萃取物在15.726 mg/cm2浓度下,处理96 h内驱避率均大于80%,并在处理96 h时达到100%的驱避率。并且,在处理48 h后石油醚萃取物3个浓度梯度的驱避率均在62%以上。乙酸乙酯萃取物的驱避率略低于石油醚萃取物,不同时间下3个浓度梯度的驱避率整体在50%以上。上述结果表明,萃取物对玉米象有较好的驱避活性,并且驱避活性物质极性较低,集中于石油醚层。

表2 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对玉米象的驱避率Tab.2 Repelling rate of different solvent extracts of endophytic fungus P.igniaria Stdif10 on S.zeamais %

2.3 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对9种植物病原真菌的抗菌活性

采用菌丝生长速率法测定了内生真菌P.igniariaStdif10石油醚和乙酸乙酯萃取物对9种植物病原真菌的抗菌活性。由表3可知,2种不同溶剂萃取物对9种供试植物病原真菌表现出不同程度的抗菌活性。石油醚萃取物抗菌活性较好,对9种植物病原真菌的EC50值介于0.054 7～0.319 8 mg/mL,均在0.32 mg/mL以下。其中,对烟草黑胫病菌和金橘砂皮病菌的抗菌活性较好,EC50值分别为0.071 6 、0.054 7 mg/mL,其次为辣椒炭疽病菌,EC50值为0.117 3 mg/mL。乙酸乙酯萃取物的抑菌活性相对较弱,对9种供试植物病原真菌的EC50值介于0.524 1～2.181 4 mg/mL。以上结果表明，内生真菌P.igniariaStdif10抗植物病原真菌活性成分主要集中在石油醚层。

2.4 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物对10种动物病原细菌的抗菌活性

采用带药培养基涂布法测定了内生真菌P.igniariaStdif10石油醚和乙酸乙酯萃取物对10种动物病原细菌的MIC值。由表4可知,2种不同溶剂萃取物对10种供试动物病原细菌有较好的抑制效果。石油醚萃取物对10种供试动物病原细菌的MIC值介于0.125～0.500 mg/mL,其中对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC值为0.125 mg/mL。乙酸乙酯萃取物对10种供试动物病原细菌的MIC值为0.250～1.000 mg/mL。石油醚萃取物抗细菌活性优于乙酸乙酯萃取物,即内生真菌P.igniariaStdif10抗动物病原细菌的活性成分主要集中在石油醚层。此外,由表4结果可以看出，2种不同溶剂萃取物对革兰氏阳性菌的抑制效果要优于革兰氏阴性菌。

表3 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物的抗真菌活性Tab.3 Antifungal activity of different solvent extracts from endophytic fungus P.igniaria Stdif10

表4 内生真菌P.igniaria Stdif10不同溶剂萃取物的抗细菌活性Tab.4 Antibacterial activity of different solvent extracts from endophytic fungus P.igniaria Stdif10

3 结论与讨论

本研究首次报道了血散薯内生真菌P.igniariaStdif10发酵产物不同溶剂萃取物的抗虫活性。血散薯内生真菌P.igniariaStdif10萃取物对玉米象具有良好的触杀活性和驱避活性,对辣椒炭疽病菌、水稻胡麻叶病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌、玉米大斑病菌、金橘砂皮病菌、贡柑链格孢菌9种植物病原真菌具有一定的抗菌活性,对产气肠杆菌、铜绿假单孢菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽杆菌10种动物病原细菌具有较好的抗菌活性。并且石油醚萃取物表现出较好的抗虫和抗菌活性,其中,对玉米象的触杀活性LC50值为2.295 1 mg/cm2。汪玉平等[18]报道，土荆芥的石油醚萃取物为25.52 mg/cm2时对玉米象有66.50%的触杀死亡率,与之相比,本研究的石油醚萃取物对玉米象有良好的触杀活性。同时,对玉米象处理48 h后,石油醚萃取物3个浓度梯度的驱避率均大于62%,同浓度相同时间下,驱避效果总体要优于水菖蒲的4种溶剂萃取物(44.41%～72.26%)[19]。另外,其对9种植物病原真菌的EC50值介于0.054 7～0.319 8 mg/mL,略高于分离自同属植物广西地不容内生真菌DBR-23的萃取物,后者对同样9种病原真菌的EC50值介于0.020 6～0.174 6 mg/mL[20]；对10种动物病原细菌的MIC值介于0.125～0.500 mg/mL,抑菌效果要优于地不容内生真菌DBR-23萃取物,后者对相应的10种动物病原细菌的MIC值介于2.500～10.000 mg/mL[21]。

综上,本研究结果表明,血散薯内生真菌P.igniariaStdif10中含有广谱的抗菌活性物质,这与其宿主植物血散薯抗菌活性作用相互印证[3-4],同时具有较好的抗虫活性,并且活性物质主要集中在石油醚层,为一些极性较小的物质,这为进一步在其中寻找生物活性成分提供了依据。下一步计划将薄层色谱法(TLC)、硅胶柱层析、高效液相色谱法(HPLC)等多种方法相结合,对石油醚萃取物进行系统分离。用TLC确定洗脱剂的最佳溶剂配比,采用硅胶柱层析进行初步分离,用紫外线灯以及碘缸分析馏分,再用HPLC进一步分离纯化。将得到的单体化合物采用多孔板-MTT细胞活力测定法,借助酶标仪检测其抗菌活性。采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H NMR)和核磁共振碳谱(13C NMR)等方法并结合相关的文献资料,比对鉴定分离得到的单体化合物的结构,从而明确该单体化合物。