番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性

高振峰,李 娜,张晓宇,韩巨才

(1.山西省农业科学院 农产品贮藏保鲜研究所,山西 太原 030031；2.山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801；3.今日农业杂志社,山西 太原 030006)

番茄灰霉病害是一种由灰葡萄孢病原(Botrytiscinerea)引起的世界性真菌病害，不仅可在田间危害，而且病原分生孢子耐低温能力强，在番茄采后低温贮藏期间亦可形成暴发，对番茄采前生长、发育和品质以及采后贮藏保鲜均具有重要影响[1-3]。目前，农业生产中该类病害防治仍以化学药剂为主。近年来由于化学农药不合理使用导致病原菌抗药性增强[4-5]、农药残留[6]、环境污染[7-8]和生态失衡[9]，给后期防治带来困难，也不利于农药行业健康可持续发展，给我国农产品安全和人类健康带来威胁，因此，新型、绿色农药产品开发成为目前植物保护领域的研究热点之一。

植物内生拮抗细菌作为一类不同于根际抗病微生物的特殊微生物，可在宿主体内与宿主和谐共生而不引起明显症状，所处环境稳定，营养来源可靠、丰富，具有同其他抗病微生物相似的抗菌物质种类、作用方式多样、抗菌谱广和不易产生抗药性等特点。部分内生细菌在侵染宿主根系进入宿主植物体内之前，还可在土壤中稳定定殖，对一些土传病害防治具有重要意义，是生物农药优秀开发源之一[10-12]。因此，近年来人们围绕内生拮抗细菌进行了大量研究，且已从番茄[13-14]、抱茎苦荬菜[15]、梓树[16]、地肤[17]和独角莲块茎[18]等植物体内分离到对B.cinerea具有良好抑制作用的内生细菌，说明内生细菌在该病害防治中具有良好应用潜力。然而相关研究仍存在一些局限性：研究数量同其他抗病微生物相比较少；抗病研究以室内测定居多，田间测定较少；抗病菌株筛选以室内离体筛选居多，田间筛选较少；部分菌株虽可在来源宿主中内生，但并未有证据表明亦可在番茄体内内生。

鉴于此，以植物内生细菌防治番茄灰霉病害研究为核心内容，采用平板对峙、利福平抗性标记与田间试验相结合的方法，对前期从梓树、花椒、番茄、抱茎苦荬菜和酸枣等植物中分离到的58株植物内生拮抗细菌的抑菌活性、定殖特性和田间防效进行测定，筛选对番茄灰霉病菌具有良好拮抗效果且可在番茄体内良好定殖的内生细菌。在此基础上对其抗真菌谱及分类地位进行研究，为后期生物菌剂和菌肥的开发与应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

1.1.1 内生细菌 菌株编号及来源见表1。58株菌株均由山西农业大学农药学实验室保存(-80 ℃)并提供。

1.1.2 植物病原真菌 番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、苹果腐烂病菌(Valsamali)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminerum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.capsicum)、梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、菜豆菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)和胡萝卜腐烂病菌(Ceratocystisfimbriata)均由山西农业大学农药学实验室保存并提供。

1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 10 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然；NA培养基：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.0；BPY培养液：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、牛肉浸膏5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

1.3 菌种活化

1.3.1 内生细菌的活化 采用接种环挑取-80 ℃甘油法保存的各内生细菌1环，于新鲜NA平板划线，并于26 ℃恒温培养48 h后用于后续试验。

1.3.2 植物病原真菌的活化 将供试植物病原真菌于试验开始前均接种至新鲜的PDA平板，26 ℃恒温培养5 d后用于后续试验。

1.4 拮抗细菌的筛选

以番茄灰霉病菌为靶标，参照谢宗华等[19]的平板对峙法(略作修改)对1.3中活化后内生细菌的拮抗效果进行测定。在超净工作台中于每培养皿(直径为90 mm)中倒入PDA 培养基15 mL，完全凝固后，用直径为5 mm的打孔器打取活化后的各植物病原真菌菌块，并用接种针接种至PDA平板中央。

表1 内生细菌编号及来源Tab.1 Number and isolation source of all endophytic bacteria

随后再用接种环挑取各内生细菌于距离植物病原真菌2 cm处进行接种，以不接种内生细菌为对照，于26 ℃恒温培养7 d后参照PRABAVATHY等[20]的方法计算各处理抑菌率。各处理和试验均重复3次。

1.5 内生细菌定殖特性研究

采用抗生素标记法对1.4中具有较好抑菌效果的内生细菌的定殖特性进行测定。

1.5.1 利福平(Rif)抗性菌株诱导 采用浓度递增的抗性诱导法对菌株的利福平抗性进行诱导，使菌株的利福平抗性达300 μg/mL。利福平抗性诱导质量浓度梯度：0.5、1、2、4、8、15、30、60、120、200、300 μg/mL。各菌株在每级利福平质量浓度下均可正常生长后，再转移至下级质量浓度进行诱导，直至菌株可在300 μg/mL利福平质量浓度下正常生长为止。

1.5.2 利福平抗性遗传稳定性测定 为明确各菌株对利福平抗性的遗传稳定性，在利福平抗性诱导结束后，采用划线法将利福平抗性菌株转接至不含利福平的NA平板上连续转接5代后，再回接至含利福平质量浓度为300 μg/mL的NA平板上检测其遗传稳定性。正常生长的细菌鉴定为阳性，反之为阴性。

1.5.3 利福平抗性菌株抑菌活性测定 为检测利福平抗性诱导过程中菌株抗菌活性是否出现下降或丧失，在明确菌株利福平抗性遗传稳定性后，再次采用平板对峙法对各抗性菌株的抑菌活性进行检测，测定方法及抑菌率计算方法同1.4，以明确利福平抗性菌株的抗菌稳定性。各处理及试验均重复3次。

1.5.4 内生细菌番茄定殖特性测定 选取当地栽培番茄品种新星101为植物材料，于26 ℃恒温催芽，待其露白后，播种于装有2 kg灭菌土壤的塑料花盆中，每盆播种10粒。五叶期间苗，每盆留取长势一致的幼苗3株，七叶期采用灌根法(每盆接种Rif抗性菌株发酵液100 mL)和喷雾法(以表面不形成液滴滴落为宜，接种浓度1.6×107cfu/mL)同时接种各内生细菌。每隔5 d接种1次，连续接种3次。于最后一次接种15 d后分别取番茄根际土壤、根系和叶片组织，并于含有Rif质量浓度为300 μg/mL的Rif抗性平板中对各菌株的定殖情况进行分析，以接种空白发酵液为对照，每处理和试验均重复3次。

1.6 内生细菌对番茄灰霉病害田间防效测定

田间应用作为生防微生物研究的最终目的，且田间因素对菌株病害防治效果具有重要影响，因此，在明确内生拮抗细菌在番茄中的定殖特性后，还需通过田间试验对其田间防效进行初步测定，以确保筛选到的目标菌株在田间也具有良好防治效果。试验设计：(1)制备发酵液。于超净工作台中使用接种环挑取1环活化后的内生细菌，接种至装有300 mL BPY发酵液的500 mL三角瓶中，于28℃、160 r/min恒温振荡培养72 h后终止发酵，获得内生细菌发酵液，用于后续田间试验。(2)番茄灰霉病害田间防效测定。于山西省晋中市太谷县阳邑乡番茄种植区，寻找3处番茄灰霉病害发病初期大棚进行田间防效测定，在喷洒前对其病情指数进行调查,随后对内生细菌发酵液稀释50 倍，并使用手持喷壶进行喷雾处理，以空白发酵液为对照，每处理喷洒番茄2行(36株)。在内生细菌50倍发酵液稀释液处理7 d后，再次调查发病指数，计算防效，从而确定内生细菌的田间防效。番茄叶片和果实灰霉病分级标准以及病情指数和防效计算参照李瑞环等[21]的方法进行。

1.7 筛选出的高效内生细菌的抗真菌谱测定

以12种植物病原真菌为筛选靶标，参照ZHANG等[22]的平板对峙法对筛选出的高效内生细菌的抗真菌谱进行测定，抑菌带越大说明抑菌效果越好。

1.8 筛选出的高效内生细菌的分类地位研究

1.8.1 形态学鉴定 采用稀释涂布法，使内生细菌于NA平板上形成单菌落，对其菌落形态进行观察和记录，从而明确内生细菌在NA平板上的菌落形态特征。

1.8.2 生理生化鉴定 参照参考文献[23-24]对内生细菌的生理化特性进行测定和鉴定。

1.8.3 16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因鉴定 参照CHEN等[25]和HASAN等[26]的细菌DNA提取方法，对内生细菌的基因组DNA进行提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，检测合格后用于16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因扩增。

以细菌通用引物27F和1492R[27]、gyrA特异引物gyrAF/gyrAR[28]以及gyrB特异引物BS-F/R[29]为扩增引物，以基因组DNA为模板，分别对内生细菌的16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因序列进行扩增。反应体系：primermix 12.5 μL、正引物0.5 μL、反引物0.5 μL、DNA 0.5 μL和ddH2O 11 μL；扩增程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性45 s、适宜退火温度下40 s、72 ℃ 延伸90 s(16S rRNA)/45 s(gyrA、gyrB)，变性、退火和延伸循环30次后，于72 ℃继续延伸10 min，最后10 ℃保存，用于电泳检测和测序。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送交北京六合华大基因公司进行常规测序。

获得测序序列后，使用Ezbiocloud website对内生细菌的16S rRNA序列同模式菌株进行比对分析；使用NCBI在线BLAST对内生细菌gyrA和gyrB序列进行比对分析，并选取适宜近缘种相关序列，采用Mega 5.0 构建NJ系统发育树，从分子生物学角度对内生细菌的分类地位进行研究。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌筛选结果

以番茄灰霉病菌为靶标，采用平板对峙法对58株不同来源内生细菌抑菌活性进行测定后发现，各菌株对B.cinerea抑菌效果差异显著，其中28株内生细菌对该病原表现出一定抑菌效果，其余菌株则无抑菌活性。28株内生细菌中，以来源于梓树叶片中的内生细菌ZSY-1对该病原抑菌活性较高，抑菌率为96.17%(表2)。说明菌株ZSY-1在抑制番茄灰霉病菌方面具有明显优势。

2.2 拮抗细菌在番茄中的定殖特性

对28株对于番茄灰霉病菌具有抑菌活性的菌株在番茄叶片、根系和根际土壤中的定殖能力进行测定后发现，28株内生细菌表现出5种现象：在根际土壤、根系和叶片组织中均稳定定殖；仅在根际土壤中定殖；在根际土壤、根系和叶片组织中均无法定殖；可在根际土壤和根系中定殖，而无法在叶片中定殖；在根际土壤中定殖与抑制番茄生长(表3)。其中，菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3、ZSJ-4在根际土壤中的定殖效果较好，接种15 d后菌落数分别为1.76×106、1.67×106、1.65×106、1.35×106cfu/g；菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3在番茄根系、叶片中的定殖效果较好，根系中菌落数分别为1.54×106、1.46×106、1.31×106cfu/g，叶片中菌落数分别为0.87×106、0.64×106、0.70×106cfu/g。菌株ZSJ-4、HJJ-1、HJG-5虽然可在番茄根际土壤中稳定定殖，但均对番茄生长产生明显抑制，造成幼苗萎焉；菌株ZSG-2、ZSJ-3、ZSY-3、HJJ-3、HJY-4、HJG-1、BJG-1、SZJ-5、SZY-1既无法在番茄根际土壤中定殖，也无法在番茄根系、叶片中定殖或对番茄生长产生抑制作用；菌株BJG-3、SZY-3可以在番茄根际土壤中定殖，但在番茄根系、叶片中定殖对番茄生长产生抑制作用。上述结果表明，菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3在番茄灰霉病害防治以及土壤病原残体清除中具有较好应用潜力。

表2 28株内生细菌对番茄灰霉病菌的抑菌活性Tab.2 Antifugnal activity of 28 endophytic bacteria against B.cinerea

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
Note:Different lowercase letters in a column mean significant differences(P<0.05).The same below.

2.3 3株内生细菌对番茄灰霉病害的田间防效

在田间对菌株ZSY-1、FG6、FJ-3的番茄灰霉病害防效进行测定后发现，菌株ZSY-1对番茄灰霉病害具有较好防治效果，对叶片的防治效果可达80.33%，对果实的防治效果可达75.10%(表4)，明显高于菌株FG-6(田间防效仅约30%)、FJ-3。说明菌株ZSY-1不仅在室内具有良好抑菌效果，而且在田间也可保持较好活性，均可保持75%以上的抑菌效果，应用潜力良好。

表3 28株内生细菌在番茄根系、叶片和根际土壤的定殖特性Tab.3 Colonization characteristic of 28 endophytic bacteria in the root,rhizosphere soil and leaf of tomato

注：—表示该菌株无法在番茄根际土壤、根系或叶片中稳定定殖；***表示该菌株对番茄生长产生抑制作用。
Note:— represents the stain didn’t colonize in plant root or rhizosphere or leaf;*** represents the strain inhibited the growth of tomato.

2.4 内生细菌ZSY-1的抗真菌谱

采用对峙法对内生细菌ZSY-1的抑菌广谱性进行测定后发现，该菌株对12种植物病原真菌均具有一定抑菌活性，其中对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、菜豆菌核病菌、苹果腐烂病菌、番茄早疫病菌抑菌效果较好，抑菌带直径均大于20 mm，分别为26.73、25.17、23.27、22.50、22.47 mm(表5，图1)；其次为西瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌，抑菌带直径分别为18.23、17.97 mm；其他病原真菌中除对棉花立枯病菌抑菌带直径达10 mm以上外，其余均小于10 mm。说明菌株ZSY-1具有较广抑菌谱，在植物病害防治中应用潜力明显。

表4 3株内生细菌对番茄灰霉病的田间防效Tab.4 Field effect of three endophytic bacteria against B.cinerea

表5 内生细菌ZSY-1对12种植物病原真菌的抑菌活性Tab.5 Antifungal activity of endophytic bacterium ZSY-1 against 12 plant pathogenic fungi

A—L：桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、苹果腐烂病菌、菜豆菌核病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麦赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、番茄枯萎病菌、胡萝卜腐烂病菌A—L:M.Fructicola,B.cinerea,A.solani,V.mali,S.sclerotiorum,C.lindemuthianum,F.oxysporum f.sp.niveum,R.solani,F.graminerum,F.oxysporum f.sp.capsicum,F.oxysporum f.sp.lycopersici and C.fimbriata,respectively图1 内生细菌ZSY-1对12种植物病原真菌的抑菌效果Fig.1 Antifungal effect of endophytic bacterium ZSY-1 against 12 plant pathogenic fungi

2.5 内生细菌ZSY-1的分类地位

2.5.1 形态特征 采用NA固体培养基对菌株ZSY-1形态特征进行观察后发现，该菌株颜色为米白色，表面干燥、褶皱，挑取时表面有较薄皮层，但内部湿润，且边缘锯齿状不整齐(图2)。

2.5.2 生理生化特性 生理生化试验结果表明，菌株ZSY-1可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、果糖，能水解淀粉，可利用葡萄糖产酸，接触酶反应呈阳性，VP反应呈阳性，为兼性厌氧菌，生长温度为15～50 ℃，且具有一定耐盐特性，可在2%～8%的盐浓度下正常生长(表6)。参照参考文献[23-24]，发现菌株ZSY-1同枯草芽孢杆菌群菌株生理生化特性基本相似。

图2 内生细菌ZSY-1的NA平板形态Fig.2 The morphological characteristics of endophytic bacterium ZSY-1 on NA medium

表6 内生细菌ZSY-1的生理生化特性Tab.6 Physiological and biochemical characters of endophytic bacterium ZSY-1

注：+表示呈阳性反应；—表示呈阴性反应。
Note:+ means positive reaction;— means negative reaction.

2.5.3 分子生物学鉴定 菌株ZSY-1的16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因序列经PCR扩增，电泳检测合格，送交华大基因测序后获得长度分别为1 417、703、718 bp的相关序列，序列NCBI登录号分别为KT381096、KT381097、KX855985。

16S rRNA基因序列经Ezbiocloud website同模式菌株进行比对分析后发现，菌株ZSY-1的16S rRNA序列同枯草芽孢杆菌群模式菌株Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T和BacillusmethylotrophicusKACC 13105T的序列相似性最高，均为99.93%；选取枯草芽孢杆菌群模式菌株和外群BacilluscereusATCC 14579T，采用Mega 5.0进行序列比对，并构建NJ系统发育树后发现，菌株ZSY-1同上述2个模式菌株聚在同一支，说明利用16S rRNA序列很难确定菌株ZSY-1的分类地位，但可确定该菌株隶属枯草芽孢杆菌群(图3)，同生理生化特性分析结果相似。

内生细菌ZSY-1gyrA序列经NCBI在线BLAST比对分析后发现，其序列分别同模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methyl-otrophicusKACC 13105T、B.velezensisNRRL B-41580T的相似性最高，均为98%；基于枯草芽孢杆菌群模式菌株和外群BacilluscereusATCC 14579TgyrA序列构建NJ系统发育树后发现，内生细菌ZSY-1同样与模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methylotrophicusKACC 13105T聚在同一支，聚类结果同16S rRNA序列结果相同(图4)，说明内生细菌ZSY-1同上述模式菌株具有较高的同源性，且还需其他特异基因辅助来进一步确定内生细菌ZSY-1的分类地位。另外，根据gyrA序列系统发育树还可发现，该特异基因在枯草芽孢杆菌群菌株有效鉴别中的精度较低，系统发育树结果同16S rRNA序列差异不大。

图3 内生细菌ZSY-1 及其近缘种基于16S rRNA序列的NJ系统发育树Fig.3 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on 16S rRNA gene sequences

gyrB作为另一段特异基因，在枯草芽孢杆菌群近缘种鉴别中具有明显优势，目前已对该群内多数菌株实现有效鉴别。内生细菌ZSY-1gyrB基因序列经NCBI在线BLAST比对分析后发现，该菌株gyrB序列同模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methylotrophicusKACC 13105T、B.velezensisNRRL B-41580T的序列相似性较高，分别为100%、99%、99%。构建系统发育树后发现，该菌株同模式菌株B.velezensisNRRL B-41580T聚在同一支，因此，将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)(图5)。

3 结论与讨论

植物内生细菌作为生物农药的开发源之一，分布广泛、存在于绝大多数植物中，在植物细菌病害、真菌病害、线虫病害生物防治中具有重要意义[30]。目前，从多种宿主植物体内分离、筛选到的对植物病、虫害具有良好活性的内生细菌多数是以室内平板筛选为主，虽然部分拮抗细菌在室内抑菌效果良好，但在田间相对恶劣环境下可能会丧失活性或活性下降。因此，本研究在利用平板对峙筛选出室内抑菌效果良好的拮抗菌株后，还以盆栽试验和大田试验分别对菌株的定殖特性和田间防效进行了测定，以期筛选出既可在番茄中定殖，又能在田间保持良好抑菌活性的优良生防菌株，为其后期开发和应用奠定基础。

采用平板对峙法，以番茄灰霉病菌为靶标对从番茄、梓树、酸枣、花椒和抱茎苦荬菜中分离到的58株内生细菌的平板抑菌活性进行测定后发现，梓树内生细菌ZSY-1抑菌活性最好，抑菌率为96.17%，其抑菌活性同已报道的地肤内生细菌D-29[17]、番茄内生放线菌FQ-017[31]、高寒草地禾草内生细菌B-401[32]相比具有更好抑菌活性，说明菌株ZSY-1在番茄灰霉病害防治中具有良好应用潜力。

图4 内生细菌ZSY-1及其近缘种基于gyrA基因序列的NJ系统发育树Fig.4 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on gyrA gene sequences

图5 内生细菌ZSY-1及其近缘种基于gyrB序列的NJ系统发育树Fig.5 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on gyrB gene sequences

在明确菌株ZSY-1的平板抑菌活性后，为进一步明确其在田间条件下的活性，采用利福平抗性标记、灌根和喷雾接种方式对其在番茄中的定殖特性和田间灰霉病害防效进行了测定。结果表明，内生细菌ZSY-1不仅可在番茄根际良好存活，而且可在根部和叶片组织良好定殖，处理15 d后，根际土壤、根系、叶片中的数量分别可达1.67×106、1.46×106、0.64×106cfu/g；田间番茄灰霉病害防效良好，叶部防效可达80.33%、果实防效可达75.10%。其定殖特性明显好于内生细菌01-144[33]、红树植物内生海洋细菌CⅢ-1[34]和番茄内生短短芽孢杆菌QGJ-6[35]；番茄灰霉病田间防效同拮抗菌TB-12[36]、生防菌株YB-81[37]、番茄内生解淀粉芽孢杆菌LNWFD-05[38]、解淀粉芽孢杆菌Ba168[39]、植物乳杆菌IMAU10014[40]相比效果更好，但同海洋芽孢杆菌B-9987[41]、生防菌株SW11[42]、番茄灰霉病拮抗细菌18BS-12[43]等菌株相比防效相似。造成这些差异的原因可能与菌株自身差异、试验条件、番茄品种、处理方式和时间不同有关，但依据上述结果仍可发现，非番茄植株土著内生细菌也可在番茄体内有效定殖，而且不同来源菌株和不同种菌株，在植物病害防治和定殖特性上存在一定差异，在后期植物内生抗病细菌研究中，除进行平板活性测定外，还需进一步加强其定殖特性和田间防效研究。

在确定菌株ZSY-1的田间应用潜力后，还对其抗菌谱进行了研究，结果发现，菌株ZSY-1不仅对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌具有较好抑菌效果，而且还对桃褐腐病菌、苹果腐烂病菌和菜豆菌核病菌具有良好抑菌效果，抑菌带直径均在20 mm以上，其抑菌带直径明显高于中药白鲜皮内生枯草芽孢杆菌TS-5[44]和生防菌株YB-81[37]；且与枯草芽孢杆菌CQ[45]、番茄灰霉生防菌B21[46]和酸枣内生解淀粉芽孢杆菌SZG-23[47]存在一定异同，说明不同菌株或不同来源菌株在抑菌特性上也存在一定差异。

细菌鉴定作为细菌资源信息统计整理和发现新种的必要措施，对查找和认识相关菌株具有一定意义，因此，在明确菌株ZSY-1的抑菌特性后，采用形态学、生理生化特性、16S rRNA和特异基因gyrA和gyrB相结合的方法对菌株ZSY-1的分类地位进行了研究，将菌株ZSY-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。在分类地位研究中发现，特异基因gyrB在枯草芽孢杆菌群菌株分类地位研究中应用优势明显[48]，使用该基因可有效实现该类群菌株的鉴定，而gyrA基因分辨率则相对较低，且在近缘种鉴定中采用传统的形态学、生理生化特性和16S rRNA鉴定很难实现有效鉴定，因此，在后续枯草芽孢杆菌群菌株分类地位研究中可以引入gyrB特异基因，且对活性较好的菌株可以进行基因组测序，从而更加准确地确定其分类地位[49]。

虽然对贝莱斯芽孢杆菌菌株ZSY-1的抑菌特性、定殖特性、田间防效和分类地位进行了初步测定，但有关菌株ZSY-1对其他病原菌的田间抑菌活性、抗菌机制、在番茄发育过程中不同时间点的定殖规律以及大田定殖规律还需进一步进行研究，以期明确菌株ZSY-1的田间应用价值，并为微生物农药和菌肥开发提供新菌株。