石榴组织培养及遗传转化技术研究进展

赵玉洁,谭 彬,李洪涛,胡青霞,季亚萍,司晓丽,赵 乾,陈延惠*

(1.河南农业大学 园艺学院,河南 郑州 450002； 2.郑州市城市园林科学研究所,河南 郑州 450003)

石榴组织培养及遗传转化技术研究进展

赵玉洁1,谭 彬1,李洪涛2,胡青霞1,季亚萍1,司晓丽1,赵 乾1,陈延惠1*

(1.河南农业大学 园艺学院,河南 郑州 450002； 2.郑州市城市园林科学研究所,河南 郑州 450003)

石榴为多年生木本植物，且遗传背景较为复杂。随着生物技术的发展与运用,组织培养与基因遗传转化技术结合的方法将成为石榴育种的新途径。从石榴组织培养和遗传转化两方面分别综述外植体的选择、愈伤组织的诱导和分化,以及遗传转化的主要方法、所用基因类型和抗生素种类、转化植株的鉴定方法等,并对石榴遗传转化研究前景进行展望。

石榴； 组织培养； 遗传转化

石榴(PunicagranatumL.)属桃金娘目石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)植物，原产伊朗、阿富汗等中亚地区，现已在中国、印度、突尼斯、美国等30多个国家种植。石榴在我国已有2 000多年的栽培历史，以山东峄城区、四川会理、云南蒙自、河南荥阳为主产区。石榴因具有较高的生态价值、经济价值、营养价值、医药价值和保健功能，日益受到消费者的青睐，其产量、消费量和种植面积逐年增加，国内外石榴产业迅速发展。目前，各国对石榴相关产业的开发力度也较大，如化妆品中所含石榴提取精华、石榴果汁及各种石榴酒等。无论作为食物或药材，石榴均有较好的研究价值和广阔的开发前景。近年来，国内外研究者对石榴的研究报道[1-5]越来越多，但国内关于石榴遗传转化研究方面的文献并不多。鉴于此，对石榴组织培养和遗传转化方面的研究进行综述，以期为石榴分子育种的研究发展提供参考。

1 石榴组织培养研究

1.1 外植体的选择

最早关于石榴组织培养的报道可追溯至1987年，Omura等[6]以石榴叶片为外植体获得再生植株。之后，国内外对石榴组织培养技术以及再生体系的建立相继进行了研究，以茎段、茎尖、叶柄、子叶等[7-12]为外植体进行组织培养先后获得成功。Shao等[13]用石榴花药培养获得四倍体植株；Zhu等[14]以玉石籽石榴的成熟叶片为外植体，诱导出愈伤组织并分化出不定芽；刘广甫等[15]以茎尖、Naik等[16]以茎段为外植体分别建立了石榴的再生体系；王雪婧[17]以黄花石榴当年生带芽茎段、叶片和花萼为外植体，系统地研究了黄花石榴的组织培养及植株再生。

目前，国内外有少量关于以石榴胚轴为外植体建立再生体系的报道。Nehanjali等[18]将石榴品种Kandhari Kabuli胚培苗的下胚轴接种至MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L培养基上，其愈伤组织诱导率达68.2%，平均不定芽再生率为3.18%，不定芽高度为3.12 cm；随后将再生不定芽诱导生根，不定根再生率达85.6%，根长为3.20 cm。Naik等[19]对石榴品种Ganesh的下胚轴进行培养，发现MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+10%椰汁培养基有利于外植体直接分化出不定芽，并且培养基中添加3.4 mg/L的AgNO3有助于提高不定芽分化率。

胚培养可以打破种子休眠，缩短育种周期，提前成苗，也可以提高杂交育种中杂种胚的成苗率。Murkute等[20]和Naik等[21]分别用石榴幼胚进行培养得到愈伤组织并成功增殖。陈延惠等[22]研究了不同接种时期对突尼斯软籽石榴幼胚萌芽率及成苗率的影响，结果表明，最佳的接种时期为8月中下旬至9月初。闵炜等[23]将大花石榴未完全成熟种子接种于MS基本培养基上，培养48 d后种子开始萌发，萌发率为33.0%。刘丽[24]认为，幼胚萌发前有短暂的休眠期，接种前用GA3浸泡处理种子有助于打破休眠，提高幼胚的萌发率。Kanwar等[25]取花后16～20周的石榴果实用于胚培养，发现在MS+6-BA 9 μmol/L+NAA 20 μmol/L培养基上愈伤组织诱导率最高，为36.4%。

1.2 愈伤组织的诱导和分化

在植物组织培养中，植物生长调节剂的种类、质量浓度和配比是诱导愈伤组织形成及其分化的最主要的因素之一。石榴外植体愈伤组织诱导常用的植物生长调节剂是细胞分裂素和生长素，细胞分裂素有6-BA、KT、ZT等，目前应用较为广泛的是6-BA，其常用的质量浓度为1.0～3.0 mg/L；生长素一般选用NAA、IAA、IBA等，NAA质量浓度一般为0.1～0.5 mg/L[26-28]。彭丽萍等[29]研究认为，培养基MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L对软籽石榴离体叶片愈伤组织诱导效果最好。程江华[30]研究表明，靠近顶端的成熟叶片更容易诱导出疏松愈伤组织，愈伤组织诱导最佳培养基为MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。愈伤组织一般分为3种：第1种为质地坚硬、块状、颜色鲜绿的胚性愈伤组织，是最重要的一类愈伤组织，用于诱导不定芽和不定根；第2种为质地疏松、易分散、不分泌黏稠液的颗粒状胚性愈伤组织，此类愈伤组织适合用于悬浮培养；第3种为柔软、水渍、性状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织，在培养过程中要淘汰此类愈伤组织。

外植体愈伤组织形成后，要进一步诱导愈伤组织分化形成不定芽。陈延惠等[31]研究认为，突尼斯软籽石榴不定芽分化的最佳培养基为MS+IAA 0.3 mg/L+KT (1.5～2.0) mg/L+TDZ 1.5 mg/L。王菲等[32]研究了泰山红、三白甜、皮亚曼、牡丹4个石榴品种叶片高频再生体系的建立，结果表明，叶片愈伤组织分化不定芽的最佳培养基和不定芽增殖最佳培养基分别为B5+6-BA 0.6 mg/L+IBA 0.5 mg/L+椰汁100 mL/L+PVP 2.0 g/L+GA31.0 mg/L和B5+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.5 mg/L+椰汁100 mL/L+PVP 2.0 g/L,其中三白甜增殖系数最高，为5.5。

1.3 生根培养

大量研究表明，培养基中矿质元素浓度较高时有助于植株茎叶生长，较低时有利于生根，所以生根培养基多采用1/2MS培养基[25,33]。石榴生根最佳基本培养基为1/2MS培养基[15,26]。同时，在培养基中加入低浓度蔗糖有利于组培苗的生根，一般为1.0%～3.0%[27]。在组培苗生根阶段生长素起至关重要的作用，常用的是NAA和IBA，其使用质量浓度在0.1～1.0 mg/L不等。范春丽[34]研究发现，河阴石榴最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L,生根率为90.0%。杜泽湘[35]研究表明，石榴新品种九州红的最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根率可达到91.2%。王峰[36]认为，河阴软籽石榴最佳生根培养基为1/2MS+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根率达到96.0%。诱导生根时，丛生芽块的大小对生根也有一定影响[24]，当1～2个丛生芽分割为一体时，其培养天数较长，增殖系数低，苗长势弱、细长，容易导致生根率低；而3～5个丛生芽为一体时，试管苗生长良好、芽体短粗，增殖系数是前者的3倍[27]。刘广甫等[15]研究发现，生根培养初期进行暗培养对组培苗生根具有较大的作用。

2 石榴遗传转化研究

2.1 石榴遗传转化主要方法

农杆菌介导法是目前果树遗传转化研究较为普遍、机制清楚、技术方法较成熟的基因转化方法，也是石榴遗传转化普遍使用的方法，它具有操作简单、成本低、导入DNA片段较大等优点[37-38]。农杆菌介导法原理是利用农杆菌中的Ti质粒或Ri质粒作为基因转化载体，将外源基因导入植物体基因组中进而完成转化。Terakami等[39]以矮化型石榴的叶片和茎段为外植体进行农杆菌介导的遗传转化，成功地将新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)和绿色荧光蛋白基因(GFP)转入石榴基因组。郭晓丽[40]用突尼斯软籽石榴的愈伤组织作为外植体，用农杆菌介导法转化抗寒基因，得到转化植株。Verma等[41]以石榴KandhariKabuli的胚、子叶和茎段为外植体，用农杆菌介导法转化抗虫基因[Cry1A(b)]和NPTⅡ，成功获得转化植株。

2.2 遗传转化所用的基因类型

石榴遗传转化研究开始较晚，早期石榴遗传转化的目的基因主要是NPTⅡ、Kan和报告基因(GUS)。随着基因克隆技术和功能基因组学的发展，近年来，改变生长习性、提高抗病虫能力等相关基因的遗传转化研究也陆续报道，如抗寒基因(CBF)、抗虫基因[Cry1A(b)]等。李跃霞[42]用石榴叶片和叶片愈伤组织作为遗传转化材料，将CBF和草丁膦乙酰转移酶基因(Bar)转入突尼斯软籽石榴。Verma等[41]成功地将Cry1A(b)和NPTⅡ转入KandhariKabuli石榴基因组。

2.3 遗传转化受体材料类别

植物基因转化受体系统的选择一般要求具有高效稳定的再生体系、较高的遗传稳定性、稳定的来源，对选择性抗生素和农杆菌侵染有一定的敏感性。由于不同品种、不同类型受体的转化效率和再生能力存在明显差异，所以实际研究中应针对不同受体材料进行转化条件、措施的筛选与优化。石榴遗传转化常用受体材料包括子叶、上胚轴、下胚轴、茎段、胚(胚性细胞)、愈伤组织、叶片等。李跃霞[42]对石榴遗传转化最佳侵染材料进行筛选，结果表明，在试验条件完全相同的情况下，叶片褐化较严重，而愈伤组织在侵染后无污染现象同时褐化率也较低，生长状态良好。郭晓丽[40]以突尼斯软籽石榴的叶片愈伤组织作为外植体进行遗传转化，获得抗性愈伤组织并分化出抗性芽。吴亚君[43]研究得出，用石榴胚培苗的子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行遗传转化，共培养3d后部分上胚轴和下胚轴褐化；选择培养15d后上胚轴全部褐化、死亡，下胚轴大部分褐化，子叶无褐化现象且能培养形成抗性芽。Verma等[41]以石榴品种KandhariKabuli的胚、子叶和茎段为外植体进行遗传转化，结果表明，子叶外植体的转化效率显著高于胚和茎段。

2.4 抗生素种类

石榴遗传转化研究中常用的抗生素有卡那霉素(Kan)、草铵膦(Glu)等。Terakami等[39]研究了矮化型nana石榴叶片对Kan的敏感性，认为选择培养时Kan最适筛选质量浓度是50mg/L。李跃霞[42]研究表明，用突尼斯软籽石榴的叶片愈伤组织为受体材料，Kan的质量浓度为50mg/L或Glu的质量浓度为20mg/L时愈伤组织增长受到明显抑制；头孢霉素(Cef)质量浓度为500mg/L时，能有效抑制侵染材料上残余菌体的生长。该结果与连红可[44]的研究结果一致，可以作为石榴遗传转化时抗生素使用浓度参考值。Verma等[41]在筛选培养基中添加30mg/LKan、500mg/LCef，成功诱导出不定芽。

2.5 遗传转化植株的鉴定

2.5.1 选择标记基因的筛选 选择标记基因方便对非转化材料进行选择，即在培养基中添加一定浓度的选择压，抑制非转化细胞的生长。选择标记基因是已知功能或已知序列的基因，具有明显区别于受体细胞遗传背景的特点，以利于外源基因导入植物细胞后的筛选工作。石榴遗传转化常用选择标记基因有NPTⅡ[39]、Bar[42]等。Terakami等[39]以矮化观赏石榴的离体叶片为外植体，将带有NPTⅡ和GFP的pBin19-sgfp表达载体导入根癌农杆菌中进行遗传转化，以NPTⅡ为选择基因进行筛选，在愈伤组织分化出的不定芽和小苗中均能检测到目的基因，且在果实中也得到表达。连红可[44]以突尼斯软籽石榴的愈伤组织为外植体进行GFP报告基因遗传转化研究，以NPTⅡ作为选择标记基因，初步建立GFP报告基因的瞬时表达体系。Verma等[41]以KandhariKabuli子叶为外植体转化Cry1A(b)基因，所用表达载体上带有NPTⅡ基因，在共培养培养基中添加一定浓度的Kan对抗性愈伤组织和不定芽进行了有效筛选。

2.5.2 分子水平的鉴定 石榴遗传转化植株分子水平的检测主要是在DNA水平上进行，如PCR快速检测、PCR-Southern杂交等方法。目前，国外文献鲜见石榴遗传转化植株分子水平鉴定的报道，国内未见相关文献。Terakami等[39]在以矮化石榴nana为受体材料的遗传转化研究中，运用PCR和PCR-Southern杂交的方法检测到目的基因整合到石榴基因组中。Verma等[41]在农杆菌介导的Cry1A(b)基因转化石榴KandhariKabuli的研究中对所得转化植株进行PCR检测，检测结果显阳性，初步认定为转基因植株。综合目前国内的遗传转化检测手段，虽然已经建立了大豆、油菜、玉米、蔬菜、烟草等遗传转化植株检测体系[45]，但尚未见较权威的石榴遗传转化检测体系，因此，建立高效遗传转化检测体系将更有助于石榴转基因研究的发展。

2.6 石榴遗传转化存在的问题和展望

从目前石榴上所转化的目的基因看,主要是选择标记基因、报告基因,而转入具有实用价值的农艺性状的基因非常少，因此，加强对调节果实品质、改善植株生长习性等相关基因的研究,将更有利于石榴产业的研究与发展。石榴遗传转化技术虽已获得一定的进展，但仍存在遗传转化效率低等问题，主要原因是缺乏完善稳定的遗传转化体系。高效的遗传转化体系以高频率的再生体系为基础,同时，转化过程中外值体基因型、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、抗生素浓度等都是高效转化体系的重要影响因子。

展望石榴遗传转化工程，除利用模式植物中已转化成功的目的基因外，加快石榴本身基因的分离和功能研究已成当务之急，未来石榴品质、性状相关基因的分离与克隆将成为研究领域的主流。组织培养、遗传转化、分子标记等技术为石榴育种提供了更为广阔的途径，是石榴产业未来研究的重要方向[46-49]。转基因生物，包括石榴在内，还面临着一些问题和挑战，如转基因生物的政策制定和调控、转基因食品标签制度等[50]。但转基因技术作为未来农业生物技术发展的必然趋势，具有广阔的前景和价值。

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Progress of Tissue Culture and Transgenic Research in Pomegranate

ZHAO Yujie1,TAN Bin1,LI Hongtao2,HU Qingxia1,JI Yaping1,SI Xiaoli1,ZHAO Qian1,CHEN Yanhui1*

(1.College of Horticulture,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Zhengzhou Science Institute of Urban Landscape and Architecture,Zhengzhou 450003,China)

Pomegranate is a perennial woody plant,and has complex genetic background.With the development and application of biological technology,the combination of tissue culture and genetic transformation would be a new way for pomegranate breeding.The tissue culture and genetic transformation of pomegranate are the main contents of present study.The selection of implants,callus induction and differentiation,genetic transformation method,types of genes and antibiotics,identification method of transformed plants and so on were summarized.The development prospect and problems of pomegranate genetic transformation were also presented in this paper.

pomegranate; tissue culture; genetic transformation

2016-10-15

郑州市都市生态农业产业体系建设项目(30601207)

赵玉洁(1988-)，女，河南开封人,在读硕士研究生,研究方向：果树育种。E-mail：z1184985369@163.com

*通讯作者：陈延惠(1963-)，女，河南南阳人，教授，硕士，主要从事园艺遗传育种方面研究。 E-mail：chenyanhui188@163.com

S665.4

A

1004-3268(2017)04-0001-05