海水中蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其对水环境中氮磷的纠正效应

王洪斌， 王 海，成 明， 李士虎(.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 005； .连云港市荣盛生物科技有限公司，江苏 连云港 54)

海水中蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其对水环境中氮磷的纠正效应

王洪斌1， 王 海1，成 明2， 李士虎1
(1.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005； 2.连云港市荣盛生物科技有限公司，江苏 连云港 222524)

为开发具有改善养殖水体富营养化作用的有益菌，从江苏连云港滩涂海水池塘分离到1个菌株，命名为HYHB-4，对其进行形态学特征及生理生化特性鉴定，并分析其16S rRNA 序列，结果表明，分离菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。研究了分离菌株对虾蟹混养围塘水环境中氮磷的纠正效应，结果显示，HYHB-4菌株中度嗜盐、嗜冷，最佳生长温度为25 ℃，超过35 ℃停止生长；在3%～5%Nacl中生长得率最高；菌株HYHB-4 对虾蟹混养围塘水环境中的氮磷具有显著的利用转化和降解作用，其中亚硝态氮(NO2-N)下降幅度最大，施用HYHB-4制剂5 d后，氨态氮(NH4-N)、硝态氮(NO3-N)、NO2-N质量浓度比起始水平分别下降77.19%、52.95%、85.27%；总磷(TP)和磷酸盐(PO4-P)比起始水平分别下降84.40%、84.67%。综上，分离的蜡状芽孢杆菌HYHB菌株-4对虾蟹混养围塘水环境中的氮磷具有纠正效应。

养殖水体； 蜡状芽孢杆菌； 分离鉴定； 氮； 磷； 纠正效应

鱼虾贝养殖过程中造成的自身污染日益成为重要的生态与环境问题，养殖池塘的污染使水体氨氮及其他无机氮、无机磷酸盐浓度增高[1]。养殖水体中的生态平衡失调，一些条件致病菌转化为有毒害的病原菌，导致水生动物病害的暴发[2]。因而，保持水体微生态系统平衡，是水生动物健康养殖中最值得关注的方面。

微生物在水产养殖生态系统的调控方面发挥着巨大作用，既是生产者又是消费者、分解者和储存者[3]。微生物具有丰富的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，可以降解养殖生态环境中的有机污染物；由于微生物具有生长快、繁殖旺等特点，其可抑制养殖生态环境中微藻的生长；微生物在生长繁殖过程中产生大量的次生代谢物，影响水生病原菌和有害藻类生长[4-6]。因此，利用微生物高效分解有机污染物,保持水生态系统平衡，且避免水生动物病害暴发，是急需解决的问题。水生环境中存在大量有益微生物，可对水域中污染物进行分解和转化，对水体污染有修复作用[7]。目前，关于如何提高养殖生态环境中降解有机物细菌的数量、种类以及养殖池中细菌降解有机物的性能等方面的报道较少。为此，本研究从未使用微生物制剂且生态环境健康的海水池塘中分离得到1株蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，并将其发酵形成制剂产品，施用于虾蟹混养池塘，研究其对养殖围塘的氮[氨态氮(NH4-N)、硝态氮(NO3-N)、亚硝态氮(NO2-N) ]、磷[总磷(TP)、磷酸盐(PO4-P)]纠正效应，旨在开发养殖水体中的益生菌，减少海域养殖业污染，改善水体富营养化，为海水养殖的可持续发展及应对生态风险奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

从江苏连云港滩涂海水围塘采集海水作为菌株分离源。

富集培养基(2216E 培养基)、菌株培养用牛肉膏蛋白胨培养基、驯化进程耐盐驯化培养基、固态发酵培养基，均按常规方法配制。

PCR 试剂为TaKaRa 公司产品，其他药品和试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离筛选 用富集培养基富集得到海水样品菌株，然后利用牛肉膏蛋白胨培养基进行菌株分离驯化培养。将驯化后的的菌液稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，25 ℃培养48 h，待菌落特征充分显现后，挑取菌落，记录菌落数[8]。将平板上长出的菌落逐个划线纯化，筛选得到1株菌株，命名为HYHB-4。

1.2.2 HYHB-4菌株生物学特性测定 对HYHB-4菌株进行形态学观察，检测生长温度、耐盐性(根据驯化进程NaCl含量依次为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，pH值为7.0)、生长曲线及常规生理生化特性[8]。

1.2.3 HYHB-4菌株分子生物学鉴定 采用CTAB法提取分离菌株基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用16S rRNA的通用引物进行PCR扩增，预期扩增长度为1 133 bp。上游引物：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃复性40 s，72 ℃延伸100 s，30个循环；72 ℃终止延伸10 min。

PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，序列提交GenBank，用MEGA 5.0软件对16S rRNA进行序列分析及同源性比较，并采用邻接法 (neighbor-joining,NJ)构建系统进化树[9]。

1.2.4 HYHB-4菌株制剂固态发酵 将HYHB-4菌株交由连云港市荣盛生物科技有限公司，通过固态发酵生产形成粉剂微生物制品。发酵工艺如下：将固态发酵培养基灭菌冷却至25 ℃，接种菌株，25 ℃浅盘无菌培养72 h，出料(粉碎、沸腾干燥)，测定菌数及水分。

1.2.5 HYHB-4菌株制剂水环境中氮磷的纠正效应 试验点选择位于连云港大板桥的滩涂梭子蟹和日本囊对虾混养池塘，面积1.3 hm2，按300 g/hm2施用，相邻的养殖池塘为对照(不使用任何微生物制剂)。

用WDC-PC水质分析仪测定海水的温度、盐度、pH值、溶解氧、电导率。

用WDC-PC水质分析仪测定水样中NH4-N、NO3-N、NO2-N及TP、PO4-P质量浓度，定时连续测定5 d。

2 结果与分析

2.1 HYHB-4菌株的生物学特性

形态学观察结果显示，HYHB-4菌株菌落边缘粗糙，乳白色，半透明，显微观察为杆菌，染色结果显示其具芽孢，穿刺培养结果显示其具鞭毛，生长适宜温度为15～35 ℃，最适温度为25 ℃，超过35 ℃即不能生长，是1株嗜冷菌；生长延迟期较长，培养6 h 后进入对数期，16 h 后进入衰亡期。使用耐盐驯化培养基培养72 h，结果显示，HYHB-4 菌株在NaCl含量为1%～9%时均能生长，特别是3%～5%生长得率最高，是1株典型的中度嗜盐菌。

由表1可以看出，HYHB-4 菌株吲哚试验、接触酶试验、明胶液化试验、MR试验均呈阳性，能发酵葡萄糖，可以利用柠檬酸盐，VP试验呈阴性，不能利用淀粉、乳糖。综上，初步确定HYHB-4菌株为蜡状芽孢杆菌。

表1 HYHB-4 菌株的生理生化试验结果

吲哚接触酶明胶液化MRVP葡萄糖淀粉乳糖柠檬酸盐++++-+--+

注:+ 表示阳性或有反应； - 表示阴性。

2.2 HYHB-4 菌株16S rRNA序列分析结果

测序结果显示，16S rRNA PCR扩增片段全长1 133 bp序列，与预期大小一致。将该序列与GenBank数据库中的序列进行比对，并构建进化树，进一步确定HYHB-4菌株为蜡状芽孢杆菌(图1)。

图1 HYHB-4 菌株基于16S rRNA序列的系统进化树

2.3 HYHB-4菌株对水环境中氮磷的纠正效应

2.3.1 水质参数 试验期间，试验组与对照组水质参数差别不明显，水体中温度16～20.5 ℃、盐度29～31、溶解氧37～40 mg/L、pH值7.8～8.2。

2.3.2 氮营养盐质量浓度 经测定，制备的蜡状芽孢菌制剂菌含量为1.78×1010cfu/g。对照组NH4-N、NO3-N、NO2-N质量浓度在试验期间无明显变化。试验组NH4-N、NO3-N、NO2-N质量浓度随着施用蜡状芽孢菌制剂时间延长持续下降(图2)。施用蜡状芽孢菌制剂前，NH4-N、NO3-N、NO2-N质量浓度分别为465.56、450.55、61.77 μg/L；施用蜡状芽孢菌制剂5 d后，NH4-N、NO3-N、NO2-N质量浓度分别为106.20、212.00、9.10 μg/L，与施用前相比，NH4-N、NO3-N、NO2-N质量浓度分别下降77.19%、52.95%、85.27%。可见，施用蜡状芽孢菌制剂对水环境中的氮具有明显的纠正效应，NO2-N下降幅度最大，其原因不仅在于蜡状芽孢杆菌对其消耗，也可能存在环境中硝化细菌对其作用的现象。

图2 氮营养盐质量浓度

2.3.3 磷营养盐质量浓度 测定结果(图3)显示，试验期间，对照组TP和PO4-P质量浓度无明显变化。在施用蜡状芽孢菌制剂5 d后，水环境中TP和PO4-P质量浓度均明显下降。施用蜡状芽孢菌制剂前，水环境中TP和PO4-P质量浓度分别为20.90、20.55 μg/L，施用蜡状芽孢菌制剂第1天下降趋势不明显，从第2天开始，下降幅度逐渐加大，第5天时水环境中TP和PO4-P质量浓度分别为3.26、3.15 μg/L，比施用蜡状芽孢菌制剂前分别下降84.40%、84.67%。由此可见，施用蜡状芽孢菌制剂对磷营养盐的利用及降解能力非常强。

图3 磷营养盐质量浓度

3 结论与讨论

对比试验前后池塘海水氮、磷含量，参照国家水质标准可以看出，池塘海水的氮含量已经大大超标，属于劣五类水质，总磷含量接近二类水质标准。施用本研究制备的蜡状芽孢菌制剂5 d后，氮、磷含量指标均达到二类水质标准，说明本研究分离筛选的蜡状芽孢杆菌HYHB-4 菌株对虾蟹养殖池塘的海水氮磷具有较强的纠正作用，对封闭式海水池塘的营养盐利用及降解作用十分明显，降低海水养殖氮磷排放的污染水平。

虾蟹混养池塘环境，由于生产过程的饵料投喂量大，饵料残余、水生动植物的代谢活动，导致池塘水质难以控制，营养盐含量丰富，可以满足微生物生长的营养需要，由于池塘养殖水环境属于封闭水体，水体温度较高，微生物生长迅速。本研究分离的HYHB-4菌株来自海水，环境适应能力强。本研究结果表明， HYHB-4 菌株对虾蟹围塘环境中的氮、磷具有强烈的利用和降解作用，有利于减少海水围塘氮磷的排放，改善围塘底质。此外，由于微生物生长迅速，影响了浮游藻类对营养盐的吸收，导致浮游藻类生长缓慢，在一定程度上可改善围塘水质，从而可有效减少围塘换水次数，增加了养殖动物的生长时间及病害发生，减低环境富营养化的压力，形成良好的生态环境。

前人研究表明[10-11]，蜡状芽孢杆菌对氮的利用能力很强，本研究结果也表明，分离菌株HYHB-4具有较强的利用及降解氮、磷的作用。环境事件的发生应该是多因素协调作用的结果，单一的蜡状芽孢杆菌HYHB-4菌株对水环境中氮磷的纠正效应还受其他各种因素的影响。本研究试验设计没有涉及其他环境因子，推广应用HYHB-4制剂前，应进行深入细致研究，以调控水产养殖生产中的水质，实现养殖污染的零排甚至负排，有利于水产经济动物的生态养殖和健康养殖。

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Isolation and Identification ofBacilluscereusin Seawater and Its Corrective Effect on Nitrogen and Phosphorus in Water Environment

WANG Hongbin1,WANG Hai1,CHENG Ming2,LI Shihu1
(1.Jiangsu Marine Resources Develepment Research Insititute,Lianyungang 222005,China; 2.Lianyungang Rongsheng Biotechnology Co.,Ltd.,Lianyungang 222524,China)

In order to isolate and identificate probiotic which can inprove the eutrophication effects of aquaculture water,one strain was isolated from the seawater pond of Lianyungang in Jiangsu province,the strain was named by HYHB-4.From morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics,combined with the 16S rRNA sequence analysis,the strain preliminarily identified asBacilluscereus.The corrective effect of nitrogen and phosphorus of the strain to the water environment in shrimp and crab polyculture pond were investigated.The results showed that the strain HYHB-4 moderate halophilic and psychrophilic,the optimum growth temperature was 25 ℃,and it would stop growing exceeding 35 ℃.The growth was highest in 3%—5% salinity.The strain HYHB-4 had significant transformation and degradation function to the nitrogen and phosphoru of water environment in shrimp and crab polyculture pond.The NO2-N had the largest decline.After using five days,the concentrate of NH4-N,NO3-N,NO2-N respectively decreased by 77.19%,52.95%,85.27% than the starting level.The TP and PO4-P respectively decreased by 84.40%,84.67% than the starting level.The experiment confirmed that the strain HYHB-4 had a significant corrective effect on the nitrogen and phosphoru of water environment in shrimp and crab polyculture pond.

aquaculture water;Bacilluscereus; isolation and identification; nitrogen; phosphorus; corrective effect

2015-10-12

江苏省科技厅农业支撑项目(BE2014336)；连云港市农业科技成果示范计划项目(SF1216)

王洪斌(1966-)，男，江苏连云港人，教授，主要从事微生物生物技术方面的研究。 E-mail：lygwhbly@126.com

S949

A

1004-3268(2016)04-0134-04