陕西省规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及敏感药物筛选

张 勇，赵兴绪(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

陕西省规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及敏感药物筛选

张 勇，赵兴绪*
(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

为了解陕西省部分规模猪场副猪嗜血杆菌株的血清型及耐药特性，以指导临床用药，防控副猪嗜血杆菌病，对陕西省3个规模化猪场共60头表现副猪嗜血杆菌症状的病猪进行病理剖检，采集肝脏、肺脏、淋巴结、关节液等进行细菌分离培养及生化试验，并对分离菌株进行耐药性试验。结果表明，分离到42株副猪嗜血杆菌，其中血清1型1株(2.38%)，4型8株(19.05%)，5型15株(35.71%)，12型3株(7.14%)，13型11株(26.19%)，其他型1株(2.38%)，未定型的有3株(7.14%)。药敏试验结果表明，分离菌株对阿奇霉素、复方新诺明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感，对左旋氧氟沙星、替米考星、庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感，对头孢噻呋钠、链霉素、红霉素、林可霉素、环丙沙星、强力霉素不敏感。

副猪嗜血杆菌； 分离； 鉴定； 药敏试验； 陕西省

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps) 病是由巴氏杆菌科的一种革兰氏阴性多型性小杆菌引起猪的多发生性浆膜炎、脑膜炎、关节炎以及高死亡率为特征的一种传染性疾病[1-4]。Hps主要危害2～25周龄的仔猪和生长猪，特别是对5～8周龄的断奶仔猪危害最大，发病率为15%～90%，病死率高达50%～90%，临床上以咳嗽、呼吸困难、跛行、被毛杂乱、母猪流产为特征[5-8]。近年来，随着规模化养猪业的快速发展，Hps病的发病率呈上升趋势，并且已成为影响仔猪生长最严重的细菌性疾病之一，成为世界性流行的疾病，危害性非常严重。Oliveira等[9]对该病进行大量研究发现，该病的血清型比较复杂，至少有15个血清型，另外还有20%以上的分离株无法确定。研究发现，在美国、德国、日本、西班牙、加拿大等国家流行的Hps血清型主要是4、5、13型[10-11]。蔡旭旺等[12]研究表明，我国当前流行的Hps血清型主要有4、5、12、13型。目前，Hps病的流行较为普遍，不同地区的优势血清型均有所不同，毒力也存在一定差异，流行的致病菌株与疫苗株不同，猪群中每头猪也至少存在1种菌株或血清型，并且缺乏交叉保护。此外，副猪嗜血杆菌病多采用药物进行预防和治疗，导致该菌的药物敏感性多变，并发时间和地域不同，该菌的耐药性也存在一定差异。因此，对Hps病的防控难度越来越大。为此，本试验对陕西省规模猪场采集临床疑似感染Hps的病料进行分离鉴定和药敏试验，以期指导临床用药，旨在为该地区Hps病的防控提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 2014年11—12月，对陕西省3家规模猪场共60头35日龄疑似患Hps病的病猪进行无菌采集病料。病料主要为肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结、心包积液、关节液等。

1.1.2 主要试剂及培养基 革兰氏染色和HE染色试剂、NAD均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，细菌微量生化反应管和药敏纸片等均购自杭州天和生物试剂有限公司，胰大豆琼脂(TSA和TSB)培养基购自美国BD公司，PCR缓冲液购自北京全式金生物技术有限公司，犊牛血清购自杭州四季生物有限公司(使用前经56 ℃灭活30 min)，金黄色葡萄球菌购自中国兽医药品监察所，普通营养琼脂平板培养基、鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基(含1%NAD)及麦康凯培养基、SS培养基、TSB液体培养基等按照常规方法进行制备。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 从疑似病猪的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结、心包积液、关节液等病料中无菌取样，将采集到的病料用酒精棉球点火迅速擦拭表面进行消毒灭菌，然后用消毒的剪刀、镊子取病变深层组织，接种于巧克力琼脂培养基和TSA培养基上经37 ℃培养24～48 h。

1.2.2 染色镜检 将从病料中分离出的菌株进行革兰氏染色镜检，将镜检结果疑似为Hps的菌落划线于添加50 mL小牛血清和0.1% NAD的TSA平板上，培养36 h后进行下一步鉴定。

1.2.3 卫星试验 将分离的疑似菌纯化后，划线接种至鲜血琼脂平板上，然后垂直接种金黄色葡萄球菌，置培养箱内37 ℃培养48 h，然后观察其是否具有卫星现象。

1.2.4 微量生化反应 首先将分离的疑似菌株分别接种于添加有10 μL NAD的葡萄糖、蔗糖、脲酶、乳糖、麦芽糖、β-半乳糖、木糖、核糖等的生化培养基中，置于37 ℃培养箱内培养24 h，然后进行氧化酶试验，以观察其生化反应情况。

1.2.5 药敏试验 采用纸片法测定分离菌株对头孢噻呋钠、阿奇霉素、替米考星、庆大霉素、红霉素、复方新诺明、磺胺甲氧嘧啶、氟苯尼考、洛美沙星、左旋氧氟沙星、诺氟沙星、林可霉素、环丙沙星、强力霉素、链霉素15种药物的耐药性。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离纯化结果

从疑似病料中分离出42株疑似Hps株，培养后可见针尖大小、圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐无色透明或灰白色半透明的菌落。革兰氏染色后，可见革兰氏阴性短小杆菌，无芽孢，细菌为明显的多形性，个别为两极浓染的球杆菌或长而弯曲的丝状菌。在鲜血琼脂平板上则可见到表皮葡萄球菌划线两侧均有灰白色、透明的不溶血菌落，而且越远离葡萄球菌菌苔的菌落越小，符合Hps培养的“卫星现象”。

2.2 Hps生化试验结果

生化试验结果表明，分离的42株Hps生化特性完全相同，即果糖、蔗糖、葡萄糖、触酶、麦芽糖、β-半乳糖、谷氨酰转移酶反应均呈阳性，而酯酶、尿素酶、吲哚、硫化氢、碱性磷酸酶、脯氨酸芳胺酶、苯丙氨酸反应均呈阴性(表1)。

2.3 Hps血清学鉴定

对分离的42株Hps进行血清分型(表2)发现，中血清1型1株(2.38%)，4型8株(19.05%)，5型15株(35.71%)，12型3株(7.14%)，13型11株(26.19%)，其他型占1株(2.38%)，未定型的有3株(7.14%)。

表1 Hps的生化反应结果

项目结果项目结果果糖+硫化氢-蔗糖+麦芽糖+葡萄糖+酯酶-尿素酶-β-半乳糖+吲哚-碱性磷酸酶-谷氨酰转移酶+脯氨酸芳胺酶-触酶+苯丙氨酸-

注：-为阴性；+为阳性。

表2 Hps的血清分型结果

血清型分离株数占总分离菌株数比例/%1型12．384型819．055型1535．7112型37．1413型1126．19其他型12．38未定型37．14共计42

2.4 Hps的药物敏感试验

由表3可知，分离到的42株Hps存在不同程度的耐药性，其中对阿奇霉素、复方新诺明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感；对左旋氧氟沙星、替米考星、庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感；对头孢噻呋钠、链霉素、红霉素、林可霉素、环丙沙星、强力霉素不敏感。

表3 Hps的药敏试验结果

药名抑菌圈直径/mm敏感程度左旋氧氟沙星23中度敏感复方新诺明33高度敏感林可霉素15不敏感红霉素16不敏感洛美沙星31高度敏感头孢噻呋钠15不敏感替米考星24中度敏感环丙沙星17不敏感诺氧沙星25中度敏感强力霉素14不敏感磺胺甲嘧啶23中度敏感氟苯尼考32高度敏感链霉素15不敏感庆大霉素22中度敏感阿奇霉素32高度敏感

3 结论与讨论

Hps是广泛存在于猪呼吸道的一种常在菌，当受到断奶、运输、环境卫生差等应激因素影响时会引起发病，同时还伴随着其他细菌性和病毒性疾病的发生。尹秀凤等[13]研究发现，猪群在暴发蓝耳病期间也可引起猪发生Hps病；米丁丹等[14]研究表明，圆环病毒2型普遍存在于猪场，Hps感染由于常继发猪圆环病毒2型感染，从而导致千万保育仔猪的死亡率不断增高，危害性非常严重。近年来，随着我国规模化养猪业的快速发展，Hps病的发病率和死亡率呈上升趋势，甚至不同地区流行的血清型也有一定差异，目前已经引起了科研人员的高度重视。本试验分离出的菌株形态、镜检特征、生化特性及卫星现象等均符合Hps的生物学特性，可见分离菌株为Hps，表明该病在陕西地区呈一定的流行性。

国外学者对Hps进行了大量研究发现，Hps的血清型比较复杂，按扩散血清分型方法来进行区分，至少可以将Hps分为15个血清型，另有20%以上的分离菌株无法定型，Cai 等[11]研究发现，美国、加拿大、英国、德国、西班牙等欧美发达国家Hps流行的血清型，主要以4型、5型和13型为主；蔡旭旺[15]研究指出，我国的Hps的血清型流行规律与欧美国家基本相似，但是由于Hps血清型较多，各型间抗原交叉保护力又比较低，不同地区流行的血清型可能不同，甚至一个猪场就存在几种血清型的情况，这给免疫带来一定困难。因此，在血清未分型的条件下应用地方分离株制备的灭活疫苗是较好的预防措施。同时，要及时进行药敏试验，可筛选出高度敏感的药物进行治疗，本试验结果表明，分离菌株对阿奇霉素、复方新诺明、氟苯尼考、洛美沙星高度敏感；对左旋氧氟沙星、替米考星、庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲氧嘧啶中度敏感；对头孢噻呋钠、链霉素、红霉素、林可霉素、环丙沙星、强力霉素不敏感。

以上结果与李富祥等[16]调查结果有一定差异，特别是本研究中对抗菌较好的头孢噻呋钠不敏感。这可能是菌株对同一种抗生素的敏感性存在一定差异及猪场是否合理用药有关。刘俊伟等[17]指出，若养猪场经常使用某种抗生素药物对母猪进行定期群体预防性混饲给药，从而导致其携带的耐药细菌通过哺乳传给仔猪，使猪群耐药性更严重。因此，在养猪生产实践中，临床治疗时应尽量避免盲目用药，特别是群体治疗时，应及时进行药敏试验，以筛选出最敏感的药物，在发病早期及时进行防治，以达到科学的防治效果。

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Isolation,Identification and Medicine Sensitivity Test ofHaemophilusparasuisin Scale Pig Farm

ZHANG Yong，ZHAO Xingxu*
(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

In order to investigate the serotype and drug resistance ofHaemophilusparasuisin some large scale pig farms in Shaanxi province,as well as to provide basis for prevention and control measures,this test carried out a pathological examination of 60 sick pigs from three large scale farms.The bacteria isolated from liver,lung,lymph node and joint fluid were collected and cultivated for further drug resistance test.The results showed that 42 strains wereisolated,and among them one strain belonged to type 1(2.38%),eight strains belonged to type 4(19.05%),fifteen strains belonged to type 5(35.71%),three strains belonged to type 12(7.14%),thirteen strains belonged to type 11(26.19%),one strain belonged to other type(2.38%) and three strains belonged to uncertain type(7.14%).Susceptibility test results showed that the isolated strains were highly sensitive to azithromycin,sulfamethoxazole,triimethoprim florfenicol and lomefloxacin,moderatelly sensitive to levofloxacin,tilmicosin,gentamicin,norfloxacin and sulfamonomethoxine,insensitive to ceftiofur sodium,streptomycin,erythromycin, lincomycin,ciprofloxacin and doxycycline.

Haemophilusparasuis； isolation； identification； medicine sensitivity test; Shaanxi province

2015-10-24

张 勇(1981-)，男，陕西安康人，兽医师,博士，主要从事动物疾病预防控制方面工作。 E-mail:ylsfzxzhangyong@163.com

*通讯作者：赵兴绪(1962-)，男，甘肃漳县人，教授，博士，主要从事动物生殖生理学和发育生物学研究。

S855.1

A

1004-3268(2016)04-0126-04