不同类型分子标记在苜蓿基因组中的检测效率分析

王健胜，侯桂玲，谢永凤(.平顶山学院，河南 平顶山 467000； .中国农业科学院 草原研究所，内蒙古 呼和浩特 0000)

不同类型分子标记在苜蓿基因组中的检测效率分析

王健胜1，侯桂玲1，谢永凤2
(1.平顶山学院，河南 平顶山 467000； 2.中国农业科学院 草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010)

为选择适合苜蓿基因组检测的分子标记，以19份国内外苜蓿种质为材料，比较分析了ISSR、SCoT、RAPD 3种标记在苜蓿基因组中的检测效率。结果表明，不同分子标记检测效率差异较大，引物筛选率以RAPD标记最高，达到41.18%；扩增总条带数和多态性条带数均以RAPD标记最多，多态性条带百分比以ISSR最高，为 96.25%；SCoT标记的有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数值均高于ISSR、RAPD标记。可见，不同分子标记在不同检测指标方面各有优劣，应综合应用。

苜蓿； 分子标记； 检测效率

苜蓿是重要的多年生豆科牧草[1]，其不仅具有高产、优质、营养丰富等特点，还具有耐旱、抗寒、抗盐碱等较强的抗逆性，这也使得苜蓿成为我国栽培面积最大的豆科牧草，其在我国西北、华北、东北的大部分地区均有广泛分布。随着我国对生态环境保护和农业发展的不断重视，苜蓿在生态治理、畜牧业发展和种植业结构调整中发挥着越来越重要的作用。

苜蓿种质资源研究是苜蓿新品种培育的重要基础，也是促进苜蓿相关产业发展的重要条件，而遗传多样性分析是苜蓿种质资源研究的主要内容之一。传统方法对苜蓿种质资源的研究主要是基于苜蓿的表型特征，该方法具有直接、简便等特点，但由于其受环境、生育期等因素的影响，使得形态标记在苜蓿遗传多样性研究中的应用受到一些限制。分子标记技术作为重要研究手段在植物种质资源研究中得到了极为广泛的应用。由于苜蓿分子标记研究起步较晚，导致苜蓿专有分子标记开发数量较少，因此现有苜蓿研究中利用的分子标记主要以随机标记为主。目前，包括AFLP[2]、RAPD[3-5]、ISSR[6-7]、SCoT[8]等多种类型分子标记都逐步被应用于苜蓿种质资源研究中。众所周知，由于不同类型分子标记是基于不同原理设计的，特定的设计特点决定了其在苜蓿基因组中具有不同的检测效率，而选择检测效率高的分子标记对提高苜蓿遗传多样性的研究效率甚为重要。前人利用分子标记对苜蓿遗传多样性进行了较多的研究，但有关不同类型分子标记检测效率比较的研究报道甚少。基于此，本研究利用RAPD、ISSR、SCoT对来自国内外的苜蓿种质作了研究，着重比较了不同分子标记在苜蓿基因组中的检测效率，以期为分子标记在苜蓿研究中的高效利用提供一定科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

苜蓿材料共19份，其中国内种质14份，国外种质5份，具体见表1。

表1 供试材料基本信息

序号名称/系列编号来源单位142IQ百绿国际草业(北京)有限公司25S43百绿国际草业(北京)有限公司3赛迪7Saidi7百绿国际草业(北京)有限公司4游客Youke百绿国际草业(北京)有限公司500385中国农业科学院草原研究所600399中国农业科学院草原研究所700038中国农业科学院草原研究所805234中国农业科学院草原研究所9三得利Sandeli百绿国际草业(北京)有限公司1008452中国农业科学院草原研究所1108432中国农业科学院草原研究所1208443中国农业科学院草原研究所1308464中国农业科学院草原研究所1408451中国农业科学院草原研究所1508440中国农业科学院草原研究所1608462中国农业科学院草原研究所1708446中国农业科学院草原研究所1808428中国农业科学院草原研究所1908426中国农业科学院草原研究所

1.2 DNA提取

每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的SDS法混合提取基因组总DNA[9]，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合工作浓度，保存备用。

1.3 分子标记检测

PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积为20 μL，反应体系的组成根据不同类型分子标记的特点对基因组DNA、引物、10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶和ddH2O进行相应的调整。

SCoT-PCR 扩增程序：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性1 min，在引物Tm值复性1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

ISSR-PCR 扩增程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，47个循环；最后72 ℃ 5 min。

RAPD-PCR 扩增程序： 94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，3个循环； 94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，37个循环；最后72 ℃ 5 min。

以上扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上保存分析，每个反应均重复3次以上。

1.4 数据统计及分析

用0、1、9标记SCoT扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为9，并建立分子数据矩阵。采用POPGEN 32软件估算SCoT标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数、多态性条带数、多态性条带百分比、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon’s信息指数和多态性信息含量。

2 结果与分析

2.1 不同类型分子标记多态引物筛选率比较

多态性引物的筛选率对苜蓿遗传多样性研究具有较大的影响，通常情况下，多态性引物筛选率越高，该类型分子标记在苜蓿多样性检测中的研究效率也就越高。从表2可以看出，3种类型分子标记在苜蓿基因组多态性检测中表现差异较大，其中，RAPD标记的多态性筛选率最高，达到了41.18%；其次是ISSR标记，其筛选率为36.36%；SCoT标记的多态性筛选率最低，只有21.54%。不同类型分子标记多态性筛选率的差异与其设计特点密切相关。

表2 不同分子标记在苜蓿中的筛选率

指标标记类型ISSRSCoTRAPD引物总数/条336517多态性引物数/条12147筛选率/%36．3621．5441．18

2.2 不同类型分子标记扩增谱带信息比较

分子标记引物扩增条带数是开展苜蓿遗传多样性分析的重要影响因素，而获得理想的多态性扩增位点数对苜蓿遗传多样性研究甚为关键。从表3可知，不同类型分子标记在苜蓿基因组中扩增表现差异较大，其在扩增总条带数、多态性条带数及多态性条带百分比方面都存在一定差异。在扩增总条带数方面，RAPD表现最好，其单个引物最多扩增出了12条带，略高于ISSR标记和SCoT标记的最大扩增条带数，RAPD的平均扩增条带数达到7.29条，明显高于ISSR标记的5.92条和SCoT标记的5.57条。在多态性条带数方面，3种标记的表现差异较小，3种标记多态性条带数的分布范围与其总扩增条带数分布范围完全一致，存在差异的主要体现在多态性条带平均数上， 单个引物扩增平均多态性条带数大小顺序依次为RAPD>ISSR>SCoT。与扩增条带数不同，多态性条带百分比可以比较有效地反映出不同分子标记的多态性检测效率，从表3可以看出，3种分子标记多态性条带百分比表现均较好，都在90%以上，其中ISSR标记的多态性条带百分比最高，达到了96.25%；其次是RAPD标记，其多态性条带百分比为95.24%；SCoT标记的多态性条带百分比最低，为92.24%。综上，在苜蓿基因组扩增方面，ISSR和SCoT表现相对较好。

表3 不同分子标记在苜蓿基因组中的扩增信息

指标项目标记类型ISSRSCoTRAPD扩增总条带数/条最大值9912最小值323平均值5．925．577．29多态性条带数/条最大值9912最小值323平均值5．755．147．14多态性条带百分比/%96．2592．2495．24

2.3 不同类型分子标记主要遗传多样性参数比较

本研究也对不同分子标记的主要遗传多样性参数作了比较分析，具体结果见表4。从表4可以看出，不同分子标记在3种主要遗传参数方面差异较大。在有效等位基因数方面，3种标记中SCoT表现最好，其平均值最大，达到了1.53个；其次是ISSR标记，平均值为1.45个，RAPD的有效等位基因数最低，只有1.48个。同时可以看出，每种标记不同引物间有效等位基因数变化都较大，其中以SCoT的变化为最大。在Nei’s基因多样性指数方面，不同类型标记间差异相对较小，其中SCoT的Nei’s基因多样性指数最大，其次是ISSR，RAPD相对最小。3种标记的Shannon’s信息指数变化趋势与前2个参数类似，其中，ISSR和SCoT的Shannon’s信息指数相对较大，都达到了0.46；RAPD的Shannon’s信息指数最小，只有0.44。从3种分子标记主要遗传多样性参数来看，SCoT综合表现相对较好。

表4 不同分子标记主要遗传多样性参数

指标项目标记类型ISSRSCoTRAPD有效等位基因数/个最大值1．741．781．67最小值1．311．171．32平均值1．501．531．48Nei’s基因多样性指数最大值0．420．430．38最小值0．210．120．23平均值0．300．310．29Shannon’s信息指数最大值0．550．630．55最小值0．340．210．38平均值0．460．460．44

2.4 不同类型分子标记多态性信息含量比较

多态性信息含量是进行分子标记评价的重要参数，从表5可以看出，每种分子标记的多态性信息含量变化均较大，其极差介于0.18～0.39，其中SCoT标记变化最大，而RAPD标记的变化最小。从多态性信息含量的最大值表现来看，SCOT表现最好。多态性信息含量平均值可以较均衡地反映出不同分子标记间的差异，从平均值可以看出，ISSR和RAPD标记多态性信息含量整体表现较好，其平均值均达到了0.33；而SCoT多态性信息含量较低，为0.31。从3种分子标记多态性信息含量的综合表现来看，RAPD和ISSR相对最好。

表5 不同分子标记的多态性信息含量

项目标记类型ISSRSCoTRAPD最大值0．410．480．41最小值0．190．090．23极差0．220．390．18平均值0．330．310．33

3 结论与讨论

分子标记技术的应用有效促进了苜蓿种质资源保护、鉴定和科学利用的研究进展，而在分子标记应用中，基因组多态性检测分析是较为重要的内容，也是选择理想分子标记类型的重要依据。近年来，随着新的分子标记技术的不断开发，越来越多的分子标记被逐步应用于苜蓿研究中，而不同分子标记的设计特点决定了其在苜蓿基因组多态性检测中具有不同的效率。因此，开展不同分子标记检测效率的比较分析具有重要意义。

本研究以19份国内外苜蓿种质为材料，选取了在苜蓿研究中应用较广的ISSR标记和RAPD标记以及应用较少的新型SCoT标记，研究这3种标记在苜蓿基因组多态性检测效率方面的差异，结果表明，不同分子标记在不同检测指标方面表现各有优劣，RAPD在引物筛选率方面表现最好，ISSR在多态性条带百分比方面表现最为突出，而SCoT的主要遗传多样性参数最高，3种标记的多态性信息含量差异较小。出现以上结果的原因可能是由不同类型分子标记的设计特点所致，RAPD标记是以单一的随机寡聚核苷酸(通常为10个碱基)作引物对基因组DNA进行随机扩增，而ISSR标记是以简单序列重复(SSR)的3′或5′端锚定的1～4个碱基作引物进行基因组DNA的扩增，与前2种标记不同，SCoT标记是利用植物基因组中ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计引物，对偏向候选功能基因区进行扩增[10-13]。可见，3种标记所具有的不同扩增目标区域及特点导致了其扩增产物产生不同的多态性。本研究结果为苜蓿分子标记的高效利用提供一定科学依据。

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Analysis on Detection Efficiency of Different Types of Molecular Markers in Alfalfa Genome

WANG Jiansheng1,HOU Guiling1,XIE Yongfeng2
(1.Pingdingshan University,Pingdingshan 467000,China; 2.Grassland Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hohhot 010010,China)

In order to select the suitable molecular marker for detection of alfalfa genome,19 domestic and foreign alfalfa germplasm as materials,the detection efficiency in alfalfa genome was compared for several types of molecular markers including ISSR,SCoT and RAPD.Results showed that there was great difference among the different types of molecular markers.The higher screening ratio of primer was found for RAPD,and it reached 41.18%.The higher number of total loci and polymorphic loci were also detected for RAPD.ISSR had the higher percentage of polymorphic loci,and its percentage of polymorphic loci reached 96.25%.For the effective allele number,Nei’s gene diversity index,Shannon’s information index,SCoT performed better than other types of molecular markers.These results demonstrated that the different molecular markers had advantages and disadvantages in different detection index, and these molecular markers should be used comprehensively.

alfalfa; molecular markers; detection efficiency

2015-10-24

河南省科技厅科技攻关项目(KJT142102110171)；平顶山市科技计划项目(2014086)

王健胜(1978-)，男，陕西礼泉人，讲师，博士，主要从事作物遗传育种研究。E-mail:wjsheng1998@163.com

S816

A

1004-3268(2016)04-0130-04