基于免疫分析的杏仁蛋白饮料中杏仁蛋白质定量方法研究

张世伟，赖心田*，王士峰，黄静敏，冯荣虎，谭贵良，刘 垚，杨国武(.深圳市计量质量检测研究院，深圳 580； .广东省中山市质量计量监督检测所，广东 中山 58403)

基于免疫分析的杏仁蛋白饮料中杏仁蛋白质定量方法研究

张世伟1，赖心田1*，王士峰1，黄静敏1，冯荣虎1，谭贵良2，刘 垚2，杨国武1
(1.深圳市计量质量检测研究院，深圳 518102； 2.广东省中山市质量计量监督检测所，广东 中山 528403)

为建立基于竞争酶联免疫分析(ELISA)的杏仁蛋白饮料中杏仁蛋白质定量方法，使用2-D电泳结合MALDI-TOF/ MS鉴定了杏仁的高丰度蛋白，分离纯化了杏仁40 ku prunin蛋白α链，并以此作为抗原制备了抗杏仁蛋白单克隆抗体，使用该抗体建立了检测杏仁蛋白质的竞争酶联免疫分析方法。该方法以杏仁可溶全蛋白作为标准品，IC50为19.6 μg/mL，线性范围为5.0～100 μg/mL(R2=0.990)。该方法特异性良好，和其他可食种子蛋白质无交叉反应。检测植物蛋白饮料样品的检出限为0.6 mg/mL，相对标准偏差<10%。使用巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌和高压灭菌的蛋白质平均回收率分别为96%、92%和81%。

杏仁； 蛋白饮料； ELISA； 定量

杏仁是蔷薇科(Rosaceae)杏的种子，分为甜杏仁和苦杏仁。苦杏仁又名北杏仁，含苦杏仁苷较高。由于苦杏仁苷经水解后产生的氢氰酸有剧毒，一般只用于入药[1]；甜杏仁又名南杏仁，含有苦杏仁苷相对较少，蛋白质含量丰富(约20%)[2]。甜杏仁蛋白质中含有人体必需的8种氨基酸, 与总氨基酸的比值(EAA/TAA) 约为30%[3]，其配比模式基本接近人体理想必需氨基酸模式，这使甜杏仁成为植物蛋白饮料的理想原料。

杏仁蛋白饮料作为消费量较大的植物蛋白饮料之一，因其味道香甜，深受消费者喜爱。杏仁蛋白饮料现行标准QB/T 2438—2006规定其蛋白质含量应≥5 g/kg。但是一些厂商基于口感或是成本的考虑，使用廉价的蛋白质替代杏仁蛋白质，如加入牛乳、大豆粉或花生乳。虽然该行为并不危害食品安全并且部分企业会在配料表上明示，但具体加入多少也因缺乏检测方法完全依赖于企业的自我宣称。因此,需要建立杏仁蛋白饮料中的杏仁蛋白质定量方法，为行业的健康发展提供可行的监控手段。

基于蛋白质组学的研究发现，组织中存在一些蛋白质，其含量与总蛋白质含量有比较稳定的比例关系，可作为蛋白质定量标志物[4-5]。因此，通过对这些蛋白质定量标志物的测定即可推算出物种的总蛋白质含量，实现物种蛋白质含量的特异性定量。本研究通过双向电泳技术确定了杏仁中的蛋白质定量标志物——Pru-1蛋白，并建立了基于该定量标志物的杏仁饮料中杏仁蛋白质的定量方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和样品 二甲基亚砜(DMSO)、四甲基联苯胺(TMB)、福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司。IPG 胶条、IPG Buffer、尿素(蛋白质组学级)、硫脲(蛋白质组学级)、碘乙酰胺(蛋白质组学级)购自美国GE 公司；二硫苏糖醇(DTT，蛋白质组学级)、CHAPS(蛋白质组学级)、考马斯亮兰R250(超纯级)均为Amresco 分装。其余试剂为国产分析纯。ELISA反应检测用试液配制见冷泉港实验室手册[6]。

杏仁样品采购于深圳农批市场和超市，甜杏仁样品产自河北省，苦杏仁样品产自甘肃省。杏仁蛋白饮料随机采购于深圳市场和网络。

1.1.2 主要仪器设备 酶标仪为iMARK (BIORAD公司)，超声破碎仪为Uibracell VCX750 (So-nics and Materials公司)，蛋白质测定仪为Kjeltec 8400(Foss公司)，垂直电泳仪为Mini-PROTEAN Tetra Cell (BIORAD公司)，电聚焦仪为 EttanIPGphor 3(GE 公司)以及高速离心机、精密电子天平等常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 2-D电泳 将杏仁用液氮研磨粉碎，使用正己烷脱脂，用7 mol/L尿素按1∶10(m/V)超声提取，提取液透析过夜脱盐，冻干得杏仁蛋白粉。将蛋白粉通过裂解液裂解，使用7 cm 非线性pH值3～10固相IPG 胶条，上样量100 μg。蛋白质样品采取被动水化方式进胶，20 ℃放置12 h。等电聚焦程序如下：分步升压：100 V、2 h，300 V、1 h，500 V、0.5 h；线性升压：500～4 000 V、4 h；分步升压：4 000 V、4 h。等电聚焦电泳结束后IPG胶条进行平衡处理。平衡结束后胶条转SDS电泳。使用4%浓缩胶和10%分离胶。电泳条件为30 V恒压预电泳30 min，随即升压至60 V 恒压电泳2～3 h 。电泳结束后采用考马斯亮蓝染色法染色。凝胶用Umax Powerlook 2100 XL 扫描后保存。目标蛋白质点挖胶送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行MALDI-TOFTOF/MS鉴定。

1.2.2 抗体的制备 目标杏仁抗原40 ku prunin亚基采用本课题组报道的切胶回收方法进行分离纯化[5]。将抗原皮下免疫Balb/c小鼠，每只剂量0.1 mL。单克隆抗体制备参考冷泉港实验室手册的方法进行[6]。

1.2.3 ELISA标准品的制备 杏仁于40 ℃鼓风干燥箱内干燥48 h后，使用锤式旋风磨进行细粉碎，使90%以上通过0.3 mm空间筛网。称取杏仁粉10 g，于40 ℃恒温条件下，使用1 000 mL蒸馏水，分5次超声提取杏仁蛋白质,每次提取时间为1 h。5次提取的提取液合并后使用GB 5009.5—2010 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中规定的凯氏定氮法测定可溶蛋白含量[7]。使用含0.07 mol/L尿素、0.001% DTT的PBS配制成400、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的标准溶液。

1.2.4 竞争ELISA操作 每孔加包被液100 μL 4 ℃孵育过夜。第2天倒掉包被液,用洗涤液洗1遍，每孔再加200 μL封闭液，37 ℃孵育3 h，倒掉封闭液。每孔加50 μL酶标单克隆抗体和50 μL样品(或为蛋白质标准溶液)，阴性对照孔用PBS代替。37 ℃反应0.5 h，然后用PBST洗3次。每孔加100 μL酶标羊抗小鼠二抗。37 ℃反应0.5 h，然后用PBST洗3次。加底物液100 μL，37 ℃反应10 min，用H2SO4终止反应,酶标仪读数。以杏仁蛋白质浓度为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线(B为样品或标准品的吸光度值，B0为空白溶液的吸光度值)。使用Origin 7.5 四参数拟合计算标准曲线的IC50。同时，采用棋盘法试验优化包被抗原和酶标抗体的最佳稀释倍数。

1.2.5 ELISA检测抗体特异性 采用1.2.4所述的提取方法提取其他植物或食品中常见的可溶蛋白，采用竞争ELISA检测抗体与其之间的交叉反应。

1.2.6 检测样品的前处理 杏仁饮料按1︰1加入含0.2%DTT的12 mol/L尿素。超声提取10 min后离心。上清液使用0.01 mol/L pH值7.4的PBS适当稀释至ELISA标准曲线线性范围(为避免变性剂和还原剂对ELISA的影响，至少需稀释100倍)。

1.2.7 杏仁蛋白饮料的模拟加工 杏仁的模拟热加工工艺参考张彩等[8]的报道。杏仁采用蒸馏水匀浆1 h，加入8%蔗糖、0.08%单甘油脂肪酸酯、0.12%蔗糖脂肪酸酯、0.04%黄原胶、0.05%海藻酸钠。继续匀浆1 h后，3 000 r/min离心10 min，保留上清，分别采用巴氏杀菌(65 ℃、30 min)、超高温灭菌(137 ℃、4 s)、高压灭菌(121 ℃、15 min)进行热加工，采用1.2.6 所述的前处理方法和1.2.4建立的ELISA方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 杏仁的蛋白组比较

确定物种蛋白的定量标志物是物种蛋白定量的关键。该定量标志物必须为稳定存在于该物种中的宏量蛋白。Femenia曾对苦杏仁和甜杏仁的脂肪酸、糖类和蛋白质含量进行检测，指出两者脂肪酸和糖类的含量相差较大，而蛋白质的含量无显著差异[9]。因此，本研究采用2-D电泳对这2种杏仁蛋白质进行分析，图1-A为甜杏仁蛋白质2-D电泳图谱，图1-B为苦杏仁蛋白质2-D电泳图谱。图1所示，甜杏仁和苦杏仁的蛋白质共同分布在5个区域(图中标注为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，2-D电泳图谱无明显差异。本研究对上述5个区域的蛋白质点进行MALDI-TOF/ MS鉴定。将蛋白质数据库的匹配结果结合分子量分析发现，这5个蛋白区域分别为Pru-1的α链、Pru-2的α链、Pru-1的β链、Pru-2的β链，完整的Pru-1(α链与β链未断裂)，说明杏仁的宏量蛋白为同属于Prunin蛋白家族的Pru-1和Pru-2。从含量上分析，这2个蛋白质占杏仁总蛋白质的80%以上，Pru-1与Pru-2的比例大约为3︰2。基于量上的考虑，本研究选用更为宏量的Pru-1作为目标抗原，并通过切胶回收，分离纯化了其40 ku的α链。

2.2 ELISA方法的评估结果

抗体的特异性是ELISA方法的重要指标之一。有报道指出，抗Prunin蛋白多抗会与玉米的50 ku γ-玉米胶蛋白(zein)和羽扇豆(Lupinusalbus)的7α-球蛋白(α-conglutin)发生交叉反应[10-11]，而这2种植物均可作为植物蛋白饮料的配料。因此为确保特异性，本研究制备了抗杏仁Pru-1的单克隆抗体。将此抗体和杏仁蛋白质进行2-D Western-blot。如图2所示，该抗体只识别Pru-1的α链。利用该抗体建立了检测杏仁蛋白质的ELISA方法。图3所示，该ELISA方法的IC50为19.6 μg/mL，线性范围为5.0～100 μg/mL(R2=0.990)。表1表明该方法特异性良好，抗体与包括羽扇豆和玉米在内的其他种子蛋白和乳蛋白均无交叉反应。

图1 甜杏仁和苦杏仁蛋白质的2-D电泳图谱

图2 杏仁蛋白质的2-D Western blot图谱

图3 杏仁蛋白质的ELISA竞争曲线

反应物IC50/(μg/mL)交叉反应率/%反应物IC50/(μg/mL)交叉反应率/%大豆可溶蛋白>2000<1．0腰果可溶蛋白>2000<1．0豌豆可溶蛋白>2000<1．0榛子可溶蛋白>2000<1．0红豆可溶蛋白>2000<1．0核桃可溶蛋白>2000<1．0绿豆可溶蛋白>2000<1．0花生可溶蛋白>2000<1．0羽扇豆可溶蛋白>2000<1．0玉米可溶蛋白>2000<1．0芸豆可溶蛋白>2000<1．0α-乳白蛋白>2000<1．0椰子可溶蛋白>2000<1．0β-乳球蛋白>2000<1．0莲子可溶蛋白>2000<1．0酪蛋白>2000<1．0

2.3 热加工对杏仁蛋白质定量的影响

本研究模拟杏仁蛋白饮料的加工工艺考察了3种杀菌方式对蛋白质含量测定的影响。基于所建立的ELISA方法，将加热前杏仁蛋白质质量浓度为10 mg/mL的杏仁蛋白乳饮料，分别采用巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌、高压灭菌后，杏仁蛋白质的检测值分别为9.6、9.2、8.1 mg/mL，回收率分别为96%、92%、81%。以上结果说明，本研究可较为准确地测定超高温瞬时灭菌的杏仁露中杏仁蛋白质含量，但是高温长时间的热加工仍会对本方法产生一定影响。由于剧烈热加工同样不利于杏仁蛋白饮料的稳定，越来越多的企业使用超高温瞬时灭菌法替代传统的高压灭菌工艺。

2.4 实际样品检测结果

本研究从深圳和网络随机购买杏仁蛋白饮料5份，采用所建立的ELISA方法和国标GB 5009.5—2010规定的凯氏定氮法进行检测[7]。以10个不含杏仁成分的植物蛋白饮料的测定结果平均值加3倍标准偏差作为方法检出限，检出限为0.6 mg/mL。所有非杏仁蛋白饮料的杏仁蛋白质定量结果均为未检出，未见假阳性，所有明示为杏仁蛋白饮料的样品均检出杏仁(表2)，平行样品间的相对标准偏差<10%。1、2、3、5号杏仁露的杏仁蛋白质测定结果和凯氏定氮法的结果较为接近，但4号样品差距较大。虽然其配料表标注含有牛奶和花生，但是作为杏仁蛋白饮料，以大量的牛奶和花生蛋白质提高蛋白质含量，有误导消费者的嫌疑。

表2 市售杏仁露样品中杏仁蛋白质含量检测结果(n=6) mg/mL

3 结论与讨论

热加工蛋白质的定量一直以来就是免疫学定量的难题。由于蛋白质在热加工中会发生变性、水解、聚集等作用，从而导致蛋白质的沉淀和抗原决定簇的破坏，严重影响到定量的准确性。冯郁蔺等[12]通过差示量热扫描法测得的杏仁蛋白质变性温度为94 ℃。张美枝等[13]报道，杏仁蛋白质在40 ℃时达到溶解度峰值，之后随温度升高溶解度显著下降，蛋白质易聚集沉淀。为避免杏仁热加工的蛋白质沉淀，杏仁蛋白饮料加工时一般需加入多种乳化剂维持产品的均相状态。然而，部分变性蛋白质只是以胶束状态存在，并不能被抗体识别。本课题组在前期的研究中发现，使用含0.1%DTT的7 mol/L尿素能显著提高变性蛋白质的溶解度[14]，并且能将不同变性程度的蛋白质还原为较为统一的状态，以同样经过变性处理的标准品，可以获得更准确的定量结果。另外，ELISA的反应模式也和定量的准确性密切相关。在热加工蛋白质定量上，采用竞争ELISA法比传统的蛋白质检测模式——双抗夹心ELISA更为准确。在ELISA方法中，双抗夹心法是经典的蛋白质检测免疫反应模式，该方法以一个包被在酶标板的抗体捕获抗原，另一带标记的抗体再结合抗原的第2个决定簇，具有特异性高、反应灵敏等优势。然而热处理会使部分蛋白质水解，从而导致抗原的2个决定簇解离，丧失结合双抗体的能力。竞争法中1个抗原分子只结合1个抗体，即使被水解，只要抗原决定簇不受破坏仍然可被抗体识别，可以较好地应用于热处理蛋白质的检测。虽然竞争法不如双抗夹心法灵敏，但是植物蛋白饮料中杏仁Prunin是宏量蛋白，一般为1～10 mg/mL，因此在方法的选用上对灵敏度的要求不苛刻，主要考虑结果的准确性。

食品中选用的配料及用量和其价值具有显著关系。一些不法商贩往往采用低价值的蛋白质掺入高价值的蛋白质制品，如在燕窝和雪蛤中使用明胶增加质量。这不仅损害了消费者的利益，还可能因为加工过程中为掩盖添加而非法使用添加剂，威胁到食品安全。由于对特定蛋白质定量上的困难，这种无秩序的添加行为一直是监管上的盲区。杏仁蛋白饮料的执行标准QB/T 2438—2006《植物蛋白饮料 杏仁露》中规定，棕榈烯酸占总脂肪酸的百分比≥0.7%，花生酸和亚麻酸之和占总脂肪酸的百分比≤0.25%，其本意即为控制在杏仁蛋白饮料中过度使用其他植物蛋白质原料(如花生和大豆)。但是部分厂商可能以脱脂的花生蛋白粉或大豆蛋白粉规避现有产品标准的监测。因此，杏仁蛋白质定量方法是一种更为根本的监控产品中杏仁蛋白质含量的技术手段。本研究以杏仁蛋白质为研究对象，采用高特异性杏仁Pru-1蛋白单克隆抗体结合变性剂进行前处理，能较准确地检测杏仁蛋白饮料中的杏仁蛋白质，同时也为核桃乳、即食雪蛤罐头等蛋白饮品中蛋白质的特异性定量探索了可行的技术路线。

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Quantitation of Apricot Kernel Protein in Apricot Kernel Protein Beverage Based on Immunoassay

ZHANG Shiwei1,LAI Xintian1*,WANG Shifeng1,HUANG Jingmin1,FENG Ronghu1,TAN Guiliang2,LIU Yao2,YANG Guowu1
(1.Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection,Shenzhen 518102,China; 2.Zhongshan Supervision Testing Institute of Quality & Metrology,Zhongshan 528403,China)

The aim of the research was to develop the quantitation method of apricot kernel protein in apricot kernel protein beverage based on competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).We applied two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF/MS to identify the high-abundant protein in apricot kernel. Pru-1 subunit α-chain with a mass of 40 ku was purified and used as antigen to prepare a specific monoclonal antibody. Using the monoclonal antibody and apricot kernel soluble protein as standard,an optimized ELISA method was established linear detection range of 5.0 to 100 μg/mL(R2=0.990). The assay did not register cross-reactivity with other edible plant seeds. The limit of detection(LOD) was 0.6 mg/mL for apricot kernel protein beverage,with relative standard deviation less than 10%.The average recovery rates were 96%,92% and 81% under the sterilization condition of pasteurization,ultra high temperature treated and autoclaved sterilization,respectively.

apricot kernel; protein beverage; enzyme linked immunosorbent assay; quantitation

2015-10-13

国家质检总局科技计划项目(2013QK274);广东省质量技术监督局科技计划项目(2013CZ05)

张世伟(1985-)，男，江西新余人，高级工程师，硕士，主要从事食品质量安全研究。E-mail：zsw_8506@163.com

*通讯作者：赖心田(1975-)，男，福建龙岩人，高级工程师，博士，主要从事食品质量安全研究。E-mail:lxintian@163.com

TS27

A

1004-3268(2016)04-0145-05